薛丁榕 田芳 李海云 楊鳳環(huán) 陳華民 何晨陽

水稻黃單胞水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的白葉枯病是世界水稻生產(chǎn)上重要的細(xì)菌性病害之一［1］。由于經(jīng)濟(jì)重要性以及遺傳可操作性，水稻-Xoo互作已成為植物-病原物互作研究的模式系統(tǒng)之一［2］。隨著KACC10331（韓國菌株）、MAFF311018（日本菌株）和PXO99A（菲律賓菌株）全基因組測序的完成［3-5］，為深入研究Xoo致病性的信號調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）是一種存在廣泛的細(xì)菌小分子第二信使，調(diào)控了毒性、生物膜形成和運(yùn)動性等諸多生物學(xué)功能［6-8］。含GGDEF結(jié)構(gòu)域的鳥苷酸環(huán)化酶（DGC）和含EAL或HD-GYP 結(jié)構(gòu)域的磷 酸二酯酶（PDE）分別控制了c-di-GMP的合成和降解［9］。GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白編碼基因在細(xì)菌基因組中廣泛存在，形成一個(gè)復(fù)雜的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［10］。

本研究比較分析上述菌株中GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的種類、數(shù)量及其序列特征，鑒別基序保守的DGC或PDE、基序退化的c-di-GMP信號受體。此外，發(fā)現(xiàn)感知外界環(huán)境信號、調(diào)控輸出結(jié)構(gòu)域活性的信號輸入結(jié)構(gòu)域，旨在為從Xoo中鑒定DGC和PDE編碼基因并研究其功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為PXO99A、MAFF311018和 KACC-10331，其核酸和氨基酸序列來源于NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP000967.1，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_007705.1，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AE013598.1）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測 利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/tools/meme）程序（參數(shù)設(shè)置motif寬度為最小3，最大50）預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2 結(jié)構(gòu)域蛋白基因的分布 運(yùn)用CGView Server作圖，分析結(jié)構(gòu)域蛋白基因在基因組的分布（參數(shù)設(shè)置為 blastx，expect = 0.0 0001，Bacterial and Plant Plastid，filter = yes，alignment_cutoff = 85，identity_cutoff = 85）。

1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用MEGA5構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［11］， 比 較 所 有 GGDEF、EAL和 HD-GYP結(jié) 構(gòu)域蛋白的相似性；采用基于JTT矩陣基礎(chǔ)模型最大相似法［12］， 構(gòu)建進(jìn)化模型（bootstrap replication=1000）［13］。

1.2.4 基因功能驗(yàn)證 基因功能驗(yàn)證包括DGC/PDE酶活性、c-di-GMP結(jié)合作用以及細(xì)菌毒性相關(guān)表型等測定［14-17］。

2 結(jié)果

2.1 GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白基因的鑒定

PXO99A、MAFF311018和 KACC10331分 別 有26、26 和25個(gè)基因編碼了GGDEF、EAL和HDGYP結(jié)構(gòu)域（表1）。PXO99A和MAFF311018基因數(shù)量和類型相同，而KACC10331則比前兩種菌株少一個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域基因（表1和表2）。

鑒定了幾個(gè)菌株特異的、只編碼GGDEF結(jié)構(gòu)域基因（表2）。PXO99A獨(dú)有PXO_02615基因，但 缺 少 與 XOO2206（MAFF311018）和 XOO2330（KACC10331）同源的基因；KACC103 31缺少與PXO_04147（PXO99A）和 XOO3786（MAFF311018）同源的基因。

2.2 GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白的同源性分析

GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白基因分散于Xoo整個(gè)基因組中，但也存在一定的集聚（圖1）。同源蛋白具有高達(dá)90％以上的序列相似性，同組聚集在一個(gè)內(nèi)部節(jié)點(diǎn)上，如單獨(dú)GGDEF結(jié)構(gòu)域聚集在藍(lán)區(qū)，單獨(dú)EAL結(jié)構(gòu)域在綠區(qū)，GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域雜合蛋白在黃區(qū)，HD-GYP結(jié)構(gòu)域在紅區(qū)。所有這些GGDEF和EAL蛋白編碼基因分散在Xoo基因組各部分，但在1800-2 900 kb的位置相對集中（圖2）。結(jié)果表明，3個(gè)菌株尤其是MAFF311018菌株和KACC10331菌株在進(jìn)化上的親緣關(guān)系很近。

2.3 DGC和PDE的預(yù)測和功能驗(yàn)證

39％的GGDEF結(jié)構(gòu)域含有GGEEF或GGDEF保守基序（其中GGEEF占62.5％），87％的含有EAL或EVL以及HD-GYP保守基序（表1和表2）。每個(gè)菌株有19個(gè)GGDEF、EAL和HD-GYP基序保守的蛋白，預(yù)測它們可能是有活性的DGC或PDE；其余退化的蛋白是c-di-GMP信號受體（表2）。

24％的GGDEF結(jié)構(gòu)域蛋白具有DGC酶活性的保守結(jié)構(gòu)，包括保守的GGDEF或GGEEF基序和I位點(diǎn)（RXXD基序）、GTP和Mg2+結(jié)合序列、GTP結(jié)合KXXXR保守序列（圖3）。PDE包含EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域蛋白兩種類型。

含EAL結(jié)構(gòu)域的PDE具有對活性非常重要的EAL/E VL和DDFGTG保守基序；RocR的R179和Q161是c-di-GMP結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)，而D295、N233、E265、E175、E352、E268、K316和 Q372是 Mg2+結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)［18］，Mg2+為PDE活性所 必須。MEME分析（圖4）表明，Xoo存在 相同的保守位點(diǎn)。含HD-GYP結(jié)構(gòu)域的PDE具有保守的HD和GYP殘基，中間間隔60或61位氨基酸，HD殘基對酶催化的影響非常關(guān)鍵。

表1 水稻白葉枯病菌c-di-GMP相關(guān)基因編碼的結(jié)構(gòu)域

已經(jīng)驗(yàn)證了部分不同結(jié)構(gòu)域蛋白的生物學(xué)功能（表2）。GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域保守的PXO_01019（PdeR）是具有c-di-GMP信號降解活性的PDE［14］；GGDEF/EAL結(jié)構(gòu)域退化的Filp（PXO_0040 3）是c-di-GMP信 號 受 體［15］；EAL單 一 結(jié) 構(gòu) 域 蛋 白PXO_04753（VieAxoo ）突變體生物膜形成明顯增多［16］；HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白 PXO_00070（RpfCxoo）突變體毒性、EPS產(chǎn)生、生物膜形成能力等有顯著變化［17］。

2.4 信號輸入結(jié)構(gòu)域的鑒定

信號輸入結(jié)構(gòu)域通過感知外部環(huán)境信號變化，調(diào)節(jié)下游輸出結(jié)構(gòu)域的活性。GGDEF、EAL和HDGYP蛋白具有多種信號接受結(jié)構(gòu)域（表1）。19％的DGC和40％的PDE具有REC結(jié)構(gòu)域，接收磷酸化信號［19］。24％的DGC和27％的PDE具有PAS結(jié)構(gòu)域，能感應(yīng)環(huán)境氧、光、氧化還原電位、小配基以及細(xì)胞總能級的變化［20］。10％的DGC和13％的PDE包含GAF結(jié)構(gòu)域，與cGMP結(jié)合后能調(diào)節(jié)催化活性［21］。HAMP僅存在于GGDEF蛋白中，與配基結(jié)合后具有調(diào)節(jié)同源二聚體受體磷酸化和甲基化的作用［22］。3個(gè)同源蛋白（PXO_02019、XOO1324和 XOO1440）具有Cache_1結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)菌趨化性的小分子識別［23］。3個(gè) 同 源 蛋 白（PXO_01741、XOO1775和XOO1879）具有CHASE3結(jié)構(gòu)域，涉及跨膜受體的信號接收［24］。

此外，11％的DGC和7％的PDE具有信號肽，48％的DGC和33％的PDE具有跨膜結(jié)構(gòu)（表1），表明這些信號肽可以透過或者錨定在細(xì)胞膜上，發(fā)生 DGC 和 PDE 活性的調(diào)節(jié)［25，26］。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)在Xoo中存在大量的c-di-GMP信號相關(guān)的基因，反映了其在細(xì)菌中具有重要的作用。其中一部分基因編碼了DGC和PDE代謝酶，控制了c-di-GMP的胞內(nèi)含量，另一部分結(jié)構(gòu)域發(fā)生退化，可能編碼了受體或結(jié)合蛋白，與c-di-GMP信號分子結(jié)合后，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌包括毒性、生物膜形成、EPS產(chǎn)生和運(yùn)動性等在內(nèi)的諸多生物學(xué)功能。然而，c-di-GMP信號途徑是一個(gè)非常復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可能存在反饋抑制c-di-GMP合成的調(diào)節(jié)作用。此外，它還與雙組份系統(tǒng)、群體感應(yīng)信號系統(tǒng)等共同發(fā)揮作用，介導(dǎo)了下游的調(diào)控反應(yīng)。

表2 水稻白葉枯病菌GGDEF、EAL和HD-GYP結(jié)構(gòu)域的保守和變異的基序

在其它一些與Xoo近緣關(guān)系相近的黃單胞細(xì)菌中，c-di-GMP信號基因的功能已獲得了驗(yàn) 證。橘黃單胞菌（X. citri subsp. citri）XAC0610（PXO_04155、XOO_3792和XOO_4021同源蛋白）具有DGC酶活性，雖然它并不具有GGDEF/GGEEF保守基序，但具有與Mg2+和GTP結(jié)合的保守位點(diǎn)［27］。水稻細(xì)菌性條斑病菌（X. oryzae pv. oryzicola）RpfG（PXO_00070、XOO_2236和XOO_2871的同源蛋白）和野油菜黃 單 胞 菌（X. campestris）RavR具 有 PDE酶 活性［28，29］。磷酸化后的RavR雜合結(jié)構(gòu)域蛋白具有PDE活性，去磷酸化后具有DGC酶活性［30］，這更加說明c-di-GMP代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。

另外，雖然已驗(yàn)證Xoo四個(gè)GGDEF、EAL和HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白的功能，但其它大多數(shù)的功能尚有待試驗(yàn)分析。目前，正在對其余蛋白進(jìn)行DGC/PDE活性、c-di-GMP結(jié)合作用以及細(xì)菌毒性相關(guān)表型等測定。

圖1 采用最大似然法構(gòu)建水稻白葉枯病菌系統(tǒng)進(jìn)化樹

4 結(jié)論

Xoo GGDEF、EAL和HD-GYP 結(jié)構(gòu)域蛋白參與了c-di-GMP信號途徑，包括作為DGC或PDE合成或降解了c-di-GMP，或作為c-di-GMP信號受體調(diào)控了細(xì)菌生物學(xué)功能。此外，多數(shù)蛋白具有感知環(huán)境信號變化的輸入結(jié)構(gòu)域，調(diào)控輸出結(jié)構(gòu)域的活性。

［1］Mew TW. Current status and future prospects of research on bacterial blight of rice［J］. Annual Review of Phytopathology, 2003, 25：359-382.

［2］Nino-Liu Do, Ronald PC, Bogdanove AJ. Xanthomonas oryzae pathovars：model pathogens of a model crop［J］. Molecular Plant Pathology, 2006, 7：303-324.

［3］Lee BM, Park YJ, Park DS, et al. The genome sequence of Xanthomonas ory zae pathovar oryzae KACC10331, the bacterial blight pathogen of rice［J］. Nucleic Acids Research, 2005, 33（2）：577-586.

［4］Ochiai, H, Inoue Y, Takeya M, et al. Genome sequence of Xanthomonas oryzae pv. oryzae suggests contribution of large numbers of effector genes and insertion sequences to its race diversity［J］.JARQ, 2005, 39：275-287.

［5］Salzberg SL, Sommer DD, Schatz MC, et al. Genome sequence and rapid evolution of the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzae PXO99A［J］. BMC Genomics, 2008, 9：204.

［6］JenalU, Malone J. Mechanisms of cyclic-di-GMP signaling in bacteria［J］. Annual Review of Genetics, 2006, 40：385-407.

［7］管文靜, 吳茂森, 何晨陽. c-di-GMP信號途徑對細(xì)菌致病性的調(diào)控作用［J］. 微生物學(xué)通報(bào), 2009, 36（3）：427-431.

圖2 水稻白葉枯病菌c-di-GMP代謝相關(guān)基因在基因組的分布

圖3 MEME分析水稻白葉枯病菌DGC的保守序列

［8］R?mlingU, Galperin MY, Gomelsky M. Cyclic di-GMP ：the first 25 years of a universal bacterial second messenger［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2013, 77（1）：1-52.

［9］Hengge R. Principles of c-di-GMP signaling in bacteria［J］.Nature Reviews Microbiology, 2009, 7（4）：263-273.

［10］Schirmer T, JenalU. Structural and mechanistic determinants of c-di-GMP signaling［J］. Nature Reviews Microbiology, 2009, 7：724-735.

［11］Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5：Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance, and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology and Evolution, 2011, 28（10）：2731-2739.

［12］Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies：An approach using the bootstrap［J］. Evolution, 1985, 39：783-791.

［13 ］Jones DT, Taylor WR, Thornton JM. The rapid generation of mutation data matrices from protein sequences［J］. Computer Applications in the Biosciences,1992, 8：275-282.

［14］Yang FH, Tian F, Sun L, et al. A novel two-component system PdeK/PdeR regulates c-di-GMP turnover and virulence of Xanthomonas oryzae pv. oryzae［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2012, 25（10）：1561-1569.

［15］Yang FH, Tian F, Li XT, et al. The degenerate EAL-GGDEF domain protein Filp functions as a cyclic di-GMP receptor and specifically interacts with the PilZ-domain protein PXO_02715 to regulate virulence in Xanthomonas oryzae pv. oryzae［J］. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2014, 27（6）：578-589.

［16］梁士敏, 楊鳳環(huán), 管文靜, 等. 水稻白葉 枯病菌EAL結(jié)構(gòu)域蛋白VieAxoo基因缺失突變和功能分析［J］. 微生物學(xué)報(bào),2011, 51：29-34.

［17］孫蕾, 吳茂森, 陳華民, 等. 水稻白葉枯病菌Δrpfxoo基因缺失突變體DSF信號產(chǎn)生和毒性表達(dá)［J］. 微生物學(xué)報(bào), 2010,50：717-723.

［18］Rao F, Yang Y, Qi Y, et al. Catalytic mechanism of cyclic di-GMP-specific phosphodiesterase：a study of the EAL domain-containing RocR from Pseudomonas aeruginosa［J］. Journal of Bacteriology,2008, 190（10）：3622-3631.

［19］Skerker JM, Prasol MS, Perchuk BS. Two-component signal transduction pathways regulating growth and cell cycle progression in a bacterium ：a system-level analysis［J］. PLoS Biology, 2005,3（10）：e334.

［20］Taylor BL, Zhulin IB. PAS domains：internal sensors of oxygen,redox potential, and light［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 1999, 63（2）：479-506.

［21］Hughes J. Phytochrome three-dimensional structures and functions［J］. Biochemical Society Transactions, 2010, 38（2 ）：710-716.

［22］Parkinson JS. Signaling mechanisms of HAMP domains in chemoreceptors and sensor kinases［J］. Annual Review of Microbiology, 2010, 64：101-22.

［23］Anantharaman V, Aravind L. Cache-a signaling domain common to animal Ca（2+）-channel subunits and a class of prokaryotic chemotaxis receptors［J］. Trends in Biochemical Sciences, 2000,25（11）：535-537.

［24］Zhulin IB, Nikolskaya AN, Galperin MY. Common extracellular sensory domains in transmembrane receptors for diverse signal transduction pathways in bacteria and archaea［J］. Journal of Bacteriology, 2003, 185：285-294.

圖4 MEME分析水稻白葉枯病菌PDE的保守序列

［25］Walter P, Johnson AE. Signal sequence recognition and protein targeting to the endoplasmic reticulum membrane［J］. Annual Review of Cell Biology, 1994, 10：87-119.

［26］Martoglio B, Dobberstein B. Signal sequences：more than just greasy peptides［J］. Trends in Cell Biology, 1998, 8（10）：410-415.

［27］Oliveira MC, Teixeira RD, Andrade MO, et al. Cooperative substrate binding by a diguanylate cyclase［J］. Journal of Molecular Biology, 2015, 427（2）：415-432.

［28］Zhang YB, Wei C, Jiang WD, et al. The HD-GYP domain protein RpfG of Xanthomonas oryzae pv. oryzicola regulates synthesis of extracellular polysaccharides that contribute to biofilm formation and virulence on rice［J］. PLoS One, 2013, 8（3）：e59428.

［29］He YW, Boon C, Zhou L, et al. Co-regulation of Xanthomonas campestris virulence by quorum sensing and a novel two-component regulatory system RavS/RavR［J］. Molecular Microbiology, 2009,71（6）：1464-1476.

［30］Tao J, Li C, Luo C, et al. RavA/RavR two-component system regulates Xanthomonas campestris pathogenesis and c-di-GMP turnover［J］. FEMS Microbiology Letters, 2014, 358（1）： 81-90.