于海川，趙杰，吳嬌*，侯貝貝，臧楠，仝溫溫

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

·基礎(chǔ)研究·

長(zhǎng)春花生物堿類化合物液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析△

于海川1,2，趙杰3，吳嬌3*，侯貝貝3，臧楠1，仝溫溫1

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.河南省分子診斷與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的：建立一種長(zhǎng)春花生物堿類化合物的液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析方法。方法：本研究采用大孔吸附樹脂柱法富集長(zhǎng)春花葉中的生物堿類化合物，經(jīng)Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm× 3 mm，1.8 μm)，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)長(zhǎng)春花生物堿類化合物進(jìn)行分離。結(jié)果：采用正離子電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定精確分子量，并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照快速鑒定出15個(gè)生物堿類化合物。結(jié)論：該方法結(jié)合了液相色譜的高分離效能與高分辨質(zhì)譜的準(zhǔn)確性及選擇性，具有快速、穩(wěn)定可靠的特點(diǎn)，可為長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制提供參考。

長(zhǎng)春花；生物堿；液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜

長(zhǎng)春花Catharanthusroseus(L.)G.Don為夾竹桃科(Apocynaceae)長(zhǎng)春花屬Catharanthus植物長(zhǎng)春花的全草，又稱雁來紅、日日新、四時(shí)春和三萬花等，是一種分布廣泛的藥用、觀賞植物[1]。長(zhǎng)春花次生代謝產(chǎn)物相對(duì)豐富，從其中已分離鑒定出130多種萜類吲哚生物堿[2-4]，其中長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春質(zhì)堿和文多靈是4種具有非常重要藥用價(jià)值的吲哚類生物堿。長(zhǎng)春質(zhì)堿、文多靈是合成長(zhǎng)春堿的前體，長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿已成為應(yīng)用最為廣泛的兩種天然植物抗腫瘤藥物[5]；阿瑪堿和蛇根堿作為高效降壓藥于臨床上使用；文多靈、環(huán)氧長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春質(zhì)堿被廣泛用于治療糖尿病等[6]。

長(zhǎng)春花植物體中的長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿僅有百萬分之幾或十萬分之幾，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床上對(duì)長(zhǎng)春堿或長(zhǎng)春新堿的特殊抗癌療效的需求。目前人們主要還是需要花費(fèi)巨額成本從長(zhǎng)春花植物體提取長(zhǎng)春花生物堿類化合物。近三十年來，科學(xué)家希望通過長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)，提高細(xì)胞中的長(zhǎng)春堿或長(zhǎng)春新堿含量，在不同植物器官的培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化[7]、添加代謝前體和誘導(dǎo)子[8]等方面做了大量工作。因此，針對(duì)長(zhǎng)春花體內(nèi)的多種具有重要藥用價(jià)值的萜類吲哚生物堿，建立一種快速、靈敏、高效、精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)對(duì)長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)條件優(yōu)化和質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要意義。

關(guān)于長(zhǎng)春花次生代謝產(chǎn)物分析測(cè)定方法的已有報(bào)道，如薄層掃描法[9]、高效液相色譜法[10]及放射性免疫測(cè)定法[11]等。但采用聯(lián)用技術(shù)同時(shí)對(duì)多種長(zhǎng)春花生物堿類化合物進(jìn)行高、精、準(zhǔn)的快速檢測(cè)尚未見報(bào)道。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是將液相的高分離效能與質(zhì)譜的強(qiáng)大結(jié)構(gòu)測(cè)定功能組合起來，為天然產(chǎn)物活性成分的快速分析提供了一個(gè)重要的新技術(shù)。四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF MS)能提供精確質(zhì)量數(shù)，通過精確的分子質(zhì)量數(shù)的匹配能發(fā)現(xiàn)和鑒定化合物，特別是非特定的目標(biāo)化合物[12]。

本試驗(yàn)采用大孔吸附樹脂分離技術(shù)獲得長(zhǎng)春花總生物堿，并運(yùn)用液相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜(LC/TOF MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)該提取物進(jìn)行化學(xué)成分分析，為長(zhǎng)春花總生物堿的制備工藝和質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 SL型高分離度快速液相色譜/Agilent 6530型四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀；Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3 mm，1.8 μm)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Hettich公司)。

1.2 材料

長(zhǎng)春花樣品采集于云南省昆明市，憑證標(biāo)本編號(hào)為CR130216，存放于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院。

2方法與結(jié)果

2.1 長(zhǎng)春花總生物堿的制備

2.1.1 樹脂的預(yù)處理 稱量AB-8大孔樹脂2 Kg，加乙醇(濃度>95%)浸泡24 h，用2 BV乙醇，以1.5 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，并保持液面高度，最后保留一定量的乙醇，浸泡12 h。然后用2～4 BV水，以1.5 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，洗至流出液加水不呈白色混濁為止。再用2 BV濃度為1 mol·L-1的鹽酸(HCl)溶液，以2 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，并浸泡2～4 h，用純水以同樣流速洗至流出液pH中性。加入2～3 BV濃度為1 mol·L-1的氫氧化鈉(NaOH)溶液，以2.0 BV·h-1的流速正向通過樹脂層，用純水以同樣流速洗至流出液pH中性。取適量裝入玻璃色譜柱(40 cm×2.4 cm)。

2.1.2 洗脫條件 樣品上柱后依次用水、30%、50%、70%、90%乙醇水溶液適量，進(jìn)行洗脫，流量為8 mL·min-1。

2.1.3 樹脂再生 用80%乙醇水溶液2000 mL洗脫柱體至大孔吸附樹脂填料顏色為白色，再用4000 mL水洗至無乙醇味，分離柱即可重復(fù)使用。

2.1.4 長(zhǎng)春花中總生物堿的提取 將采集的樣品經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，過60目篩，備用。取等量長(zhǎng)春花樣品，用80%的甲醇浸泡，超聲提取3次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮，加適量水稀釋后過濾，進(jìn)行AB-8大孔樹脂吸附，然后用30%、50%、70%、90%乙醇水梯度洗脫。將70%乙醇水洗脫液減壓蒸干，稱重，用色譜純甲醇溶解定容，離心，取上清，微量移液槍取10 μL，定容至1 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾后備用。

2.2 長(zhǎng)春花總生物堿液質(zhì)聯(lián)用分析

2.2.1 供試品制備 稱取2.1.4所制得的長(zhǎng)春花總生物堿20.0 mg，加入20 mL甲醇，振蕩20 min，于6000 r·min-1、低溫條件下離心10 min，取上清液，得到約20 mL甲醇溶液。將20 mL甲醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，用色譜甲醇定容至5 mL，過0.22 μm濾膜，待分析。

2.2.2 分析條件 色譜條件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×3 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，洗脫程序?yàn)? min 5% A，17 min 90% A，20 min 90% A，25 min 5% A；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量，5 μL；單個(gè)樣品運(yùn)行時(shí)間為25 min。

質(zhì)譜條件：ESI(+)，干燥氣為氮?dú)?N2)；溫度為350 ℃；流速為10 L·min-1；霧化氣壓力為241.325 KPa；鞘氣溫度為400 ℃，流速為12 L·min-1；毛細(xì)管電壓為3500 V；噴嘴電壓為0 V；碎裂電壓為75 V；離子掃描范圍m/z100～1000；正模式參比離子為121.0855、922.0922。

2.2.3 樣品分析 將供試品溶液放入自動(dòng)進(jìn)樣器中，按選定的測(cè)試條件進(jìn)行檢測(cè)，得供試品的總離子流色譜圖，見圖1。

2.2.4 總離子流色譜圖中化合物的鑒定 根據(jù)飛行時(shí)間質(zhì)譜所測(cè)定的[M+H]+值及質(zhì)譜圖譜，通過將LC-TOF-MS檢測(cè)到的化合物的精確分子量試驗(yàn)值與理論值進(jìn)行匹配，計(jì)算其誤差，對(duì)誤差<10 ppm的化合物在ChemSpider database、PubChem Compound Database和Dictionary of Natural Products等軟件中進(jìn)行匹配和檢索，鑒定出15個(gè)化合物，結(jié)果見表1。

圖1 長(zhǎng)春花生物堿類化合物的總離子流色普?qǐng)D

表1 長(zhǎng)春花生物堿類化合物的LC/ESI-TOF MS分析結(jié)果

3 討論

本文首次運(yùn)用LC/Q-TOF MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)長(zhǎng)春花生物堿類化合物進(jìn)行分析研究，根據(jù)質(zhì)譜和精確分子量，通過參考長(zhǎng)春花化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)[3]、檢索天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫等方法，鑒定出乙醇提取物中的15個(gè)生物堿類化合物。

ESI源霧化室噴嘴電壓的大小會(huì)影響進(jìn)入毛細(xì)管之前的液滴的帶電情況，當(dāng)毛細(xì)管電壓為3500 V時(shí)，設(shè)置噴嘴電壓為0 V，使兩者之間的壓力差為最大值，有利于所有液滴帶電，這樣進(jìn)入毛細(xì)管的離子數(shù)量達(dá)到最多，從而實(shí)現(xiàn)無歧視檢測(cè)所有小分子代謝物的信息；當(dāng)設(shè)置噴嘴電壓為800 V時(shí)，幾乎檢測(cè)不到樣品中的離子信息。根據(jù)安捷倫噴射離子流聚焦技術(shù)，在霧化氣周圍添加同軸鞘氣，并通過提高電噴霧帶電液滴的空間聚焦來提高M(jìn)S的靈敏度，進(jìn)而提高離子化效率和去溶劑化效率。將進(jìn)入毛細(xì)管之前的離子束進(jìn)行壓縮，達(dá)到減少離子擴(kuò)散、引入更多離子到毛細(xì)管中、減少中性溶劑束進(jìn)入質(zhì)譜、降低噪音、提高靈敏度的目的。鞘氣溫度與鞘氣流速有關(guān)，合適的溫度為400 ℃，流速為12 L·min-1。

LC-TOF/MS采用高純氮?dú)庾鳛楦稍餁?，用于?duì)霧化后的液滴進(jìn)行干燥，其溫度的高低和流速大小對(duì)分析結(jié)果有一定的影響。此外，干燥氣溫度與溶劑的蒸汽壓有關(guān)，蒸汽壓越低的溶劑所需干燥氣的溫度就越高，推薦干燥氣流速宜設(shè)為6～12 L·min-1，溫度宜設(shè)為300～350 ℃。本研究根據(jù)長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和文多靈對(duì)照樣品的出峰情況，在適宜范圍內(nèi)調(diào)節(jié)后，根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)置干燥氣溫度為350 ℃，干燥氣流速為9 L·min-1。

通過采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)快速檢出長(zhǎng)春花生物堿類化合物，對(duì)長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)工藝進(jìn)行合理地指導(dǎo)和優(yōu)化，為其質(zhì)量控制提供參考。

[1] 祖元?jiǎng)?，羅猛，牟璠松，等.長(zhǎng)春花生物堿成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18(2)：325-329.

[2] Memelink J，Verpoorte R，Kijne J W.ORCAnization of jasmonate-responsive gene expression in alkaloid metabolism[J].Trends Plant Sci，2001，6(5)：212-219.

[3] Rischer H，Oresic M，Seppanen-Laakso T，et al.Gene-to-metabolite networks for terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(14)：5614-5619.

[4] 鐘祥章，王國(guó)才，王英，等.長(zhǎng)春花地上部分單吲哚類生物堿成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(4)：471-475.

[5] Johnson D A，Laguzza B C.Antitumor xenograft activity with a conjugate of a Vinca derivative and the squamous carcinoma-reactive monoclonal antibody PF1/D[J].Cancer Res，1987，47(12)：3118-3122.

[6] Van Der Heijden R，Jacobs D I，Snoeijer W，et al.The Catharanthus alkaloids：pharmacognosy and biotechnology[J].Curr Med Chem，2004，11(5)：607-628.

[7] Choi P S，Kim Y D，Choi K M，et al.Plant regeneration from hairy-root cultures transformed by infection with Agrobacterium rhizogenes in Catharanthus roseus[J].Plant Cell Rep，2004，22(11)：828-831.

[8] Xu M，Dong J.Elicitor-induced nitric oxide burst is essential for triggering catharanthine synthesis in Catharanthus roseus suspension cells[J].Appl Microbiol Biotechnol，2005，67(1)：40-44.

[9] Tam M N，Nikolova-Damyanova B，Pyuskyulev B.Quantitative thin layer chromatography of indole alkaloids.II.Catharanthine and vindoline[J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies，1995，18(5)：849-854.

[10] Tikhomiroff C，Jolicoeur M.Screening of Catharanthus roseus secondary metabolites by high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2002，955(1)：87-93.

[11] Owellen J，Blair M，Van Tosh A，et al.Determination of tissue concentrations of vinca alkaloids by radioimmunoassay[J].Cancer Treat Rep，1981，65(5-6)：469-475.

[12] Xie C，Zhong D，Yu K，et al.Recent advances in metabolite identification and quantitative bioanalysis by LC-Q-TOF MS[J].Bioanalysis，2012，4(8)：937-959.

LC/Q-TOF MS Analysis of Alkaloids fromCatharanthusroseus

YU Haichuan1,2，ZHAO Jie3，WU Jiao3*，HOU Beibei3，ZANG Nan1，TONG Wenwen1

(1.School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China;2.Henan Collaborative Innovation Center of Molecular Diagnosis and Laboratory Medicine, Xinxiang 453003, China;3.School of Pharmacy, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective：The study is aimed to identify the alkaloids ofCatharanthusroseuby LC/Q-TOF MS.Methods：An Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(100 mm× 3 mm，1.8 μm)column was used for the separation of the related substances with a mixture of acetonitrile and 0.1% formic acid buffer solution as the mobile phase by gradient elution.Results：The alkaloids were speculated by electrospray positive ionization LC-TOF/MS accurate ion mass，and verified further through standard substances determination.Alkaloids were separated under the established HPLC condition.Fifteen related alkaloids were characterized.Conclusion：The LC-MS method is useful for the identification of the alkaloids ofC.roseuand the results obtained are valuable for its manufacturing process and quality control.

Catharanthusroseus；alkaloids；LC/Q-TOF MS

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.009

2015-01-22)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301135)；河南省教育廳重點(diǎn)課題(13B350215/14B320015)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(100403/505002)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研培育基金(2014QN150)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(201310472054/201310472055)

*

吳嬌，副教授，博士，研究方向：中藥和天然藥物的生物活性及其作用機(jī)理研究；Tel：(0373)3831981，E-mail：wujiao@xxmu.edu.cn