譚秀芳，樊叢照，李曉瑾，*，李陽，辛雅仙

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

·專題·

基于ITS、psbA-trnH及matK序列的羅布麻資源分子系統(tǒng)學(xué)研究△

譚秀芳1，樊叢照2，李曉瑾1，2*，李陽1，辛雅仙1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002)

目的：從分子生物學(xué)角度研究羅布麻屬植物種間差異，為確定《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》中的植物基原提供依據(jù)。方法：采用DNA條形碼ITS、psbA-trnH及matK序列對(duì)羅布麻、白麻及大葉白麻55份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增并雙向測序，比較種內(nèi)種間變異，基于K2P模型進(jìn)行遺傳距離分析，并構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹。結(jié)果：羅布麻、白麻及大葉白麻ITS序列種內(nèi)及種間K2P遺傳距離無顯著差異，NJ樹聚為一支；羅布麻與白麻及大葉白麻之間psbA-trnH和matK序列種內(nèi)最大K2P遺傳距離明顯小于種間最小K2P遺傳距離，NJ樹顯示羅布麻與白麻及大葉白麻均單獨(dú)聚為一支；白麻與大葉白麻psbA-trnH和matK序列無差異，NJ樹均為一支。結(jié)論：基于ITS、psbA-trnH及matK序列鑒定結(jié)果，《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》將藥材羅布麻的基原定為大葉白麻Poacynumhendersonii值得商榷。

羅布麻；DNA條形碼；基原；ITS；psbA-trnH；matK

羅布麻ApocynumvenetumLinn.系夾竹桃科Apocynaceae羅布麻屬多年生宿根草本植物，藥用部位為花和葉，具有抗氧化、降壓、抗抑郁、強(qiáng)心、抗菌等作用[1-2]?！吨腥A人民共和國藥典》2010版及《新疆維吾爾自治區(qū)中藥維吾爾藥飲片炮制規(guī)范》中收載“羅布麻”基原為羅布麻A.venetum[3-4]，《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載“羅布麻”基原則為大葉白麻Poacynumhendersonii(俗稱大花羅布麻)[5]。而植物學(xué)界對(duì)羅布麻基原的種屬存有爭議，在《中國植物志》中將羅布麻A.Venetum歸在羅布麻屬，白麻P.pictum及大葉白麻P.hendersonii則歸白麻屬[6]，F(xiàn)lora of China(植物分類數(shù)據(jù)庫)則取消了白麻屬，將白麻P.pictum歸入羅布麻屬，而未記載大葉白麻P.hendersonii[7]。這種學(xué)術(shù)分歧直接影響《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)羅布麻基原表述的權(quán)威性和準(zhǔn)確性，因此，進(jìn)一步明確羅布麻種屬，對(duì)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)的制定及維吾爾藥材的標(biāo)準(zhǔn)化、現(xiàn)代化具有重要的意義。

DNA條形碼鑒定技術(shù)[8]應(yīng)用于物種鑒定已成為植物學(xué)界共識(shí)，Kress等[9-10]建議將核基因ITS序列及葉綠體間隔區(qū)psbA-trnH作為條形碼，對(duì)開花植物進(jìn)行鑒定；中國植物條形碼工作組建議將ITS/ITS2作為種子植物核心條形碼[11]；陳士林等[12-14]建立了以ITS/ITS2為主體，psbA-trnH為輔的中藥材鑒定體系，Lahaye等[15-17]證明葉綠體基因matK序列在某些類群中種間、種下的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了一定的價(jià)值。張衛(wèi)明等[18-19]基于ITS、trnL和trnL-F序列，鑒定了羅布麻、白麻及大葉白麻。ITS序列不能將三者區(qū)分；trnL和trnL-F序列可區(qū)分羅布麻與白麻。為進(jìn)一步明確羅布麻各種之間的關(guān)系，本研究采用DNA條形碼ITS、psbA-trnH及matK序列，進(jìn)一步檢測、分析三者之間的差異，為明確維吾爾藥材羅布麻的基原，提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究的55份實(shí)驗(yàn)樣品葉片收集于新疆各地及藥材市場，樣品由新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所王果平副研究員鑒定。憑證標(biāo)本保存于新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本館(新疆XTNM)，實(shí)驗(yàn)所獲得的單倍型序列已提交至GenBank，詳見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)材料信息

表1(續(xù))

1.1.1 試劑 PCR擴(kuò)增所用引物由上海生工生物工程合成，DNA提取試劑盒、DNA聚合酶及dNTP等均購自天根生化科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 DNA提取研磨儀(GT-100)，北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司；離心機(jī)(Anker TGL-16C)，上海安亭科學(xué)儀器；PCR擴(kuò)增儀(070-851PCR)，德國An Analytik Jena公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及檢測 稱取干燥葉片30 mg，DNA提取研磨儀1 000r·min-1研磨2 min，植物DNA提取試劑盒提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質(zhì)量。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測序 ITS、psbA-trnH及matK序列PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參見《中藥DNA條形碼分子鑒定》[20]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測并純化后，使用ABI 3730 XL(Applied Biosystems Co.，USA)測序儀進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測序峰圖用CodonCode Aligner V 4.0.4(Codon Code Co.，USA)校對(duì)拼接，去除引物區(qū)。將所有序列由軟件MEGA5.1(molecular evolutionary genetics

analysis)分析比對(duì)[21]，基于K2P模型分析種內(nèi)和種間變異[22]。選擇不同單倍型序列，用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，使用bootstrap(1000次重復(fù))檢驗(yàn)各分支的支持率[23]。

2 結(jié)果

2.1 序列信息及變異結(jié)果

羅布麻、白麻和大葉白麻實(shí)驗(yàn)樣本的ITS序列長度變化范圍為689-692 bp，單倍型數(shù)分別為7、11、6，GC含量為61.0～61.3%；psbA-trnH序列長度變化范圍為301-323 bp，單倍型數(shù)分別為3、5、1，GC含量為34.4～36.5%；matK序列長度均為838-840 bp，單倍型數(shù)分別為3、4、1，GC含量為34.2%～34.6%，詳見表2。

表2 樣品ITS、psbA-trnH及matK序列特征

2.2 種內(nèi)及種間K2P距離分析

羅布麻、白麻及大葉白麻種內(nèi)K2P距離如表3所示，羅布麻ITS序列種內(nèi)最大K2P距離為0.004，平均值為0.001 3；白麻ITS序列種內(nèi)最大K2P距離為0.003，平均值為0.001；大葉白麻種內(nèi)最大K2P距離為0.004，平均值為0.001。羅布麻psbA-trnH序列種內(nèi)最大K2P距離為0.003，平均值為0.002；白麻psbA-trnH序列種內(nèi)最大K2P距離為0.007，平均值為0.004；大葉白麻psbA-trnH序列種內(nèi)無變異。羅布麻matK序列種內(nèi)最大K2P距離為0.001，平均值為0.0006；白麻matK序列種內(nèi)最大K2P距離為0.006，平均值為0.003；大葉白麻matK序列種內(nèi)無變異。

表3 ITS、psbA-trnH及matK序列種內(nèi)K2P距離比較

羅布麻與白麻種間ITS序列種間最小K2P距離為0，平均值為0.009；羅布麻與大葉白麻ITS序列種間最小及平均K2P距離均為0.007；白麻與大葉白麻ITS序列種間最小K2P距離為0，平均值為0.002。羅布麻與白麻種間psbA-trnH序列種間最小K2P距離為0.007，平均值為0.009；羅布麻與大葉白麻psbA-trnH序列種間最小及平均K2P距離均為0.004；白麻與大葉白麻psbA-trnH序列種間最小K2P距離為0，平均值為0.002。羅布麻與白麻種間matK序列種間最小K2P距離為0.004，平均值為0.006；羅布麻與大葉白麻matK序列種間最小K2P距離為0.004，平均值為0.005；白麻與大葉白麻matK序列種間最小K2P距離為0，平均值為0.002，詳見表4。

2.3 DNA條形碼ITS、psbA-trnH、matK序列種內(nèi)及種間變異結(jié)果

實(shí)驗(yàn)樣本的ITS序列總變異位點(diǎn)數(shù)為18，包括13個(gè)堿基變異及5個(gè)插入/缺失變異，羅布麻、白麻及大葉白麻種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)分別為5、11、7(圖1)；psbA-trnH序列中總變異位點(diǎn)數(shù)為27，包括4個(gè)堿基變異和23個(gè)插入/缺失變異，羅布麻、白麻及大葉白麻種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)分別為2、2、0，羅布麻與白麻、大葉白麻在178 bp位點(diǎn)的A-C及287 bp位點(diǎn)的G-A存在信息變異位點(diǎn)(圖2)；matK序列中總變異位點(diǎn)數(shù)為11，均為堿基變異，羅布麻、白麻及大葉白麻種內(nèi)變異位點(diǎn)數(shù)分別為2、5、0，87 bp位點(diǎn)的C-A變異、472 bp位點(diǎn)的C-T變異及495 bp位點(diǎn)的G-T變異為信息變異位點(diǎn)(圖3)。

表4 ITS、psbA-trnH及matK序列種間K2P距離比較

圖1 不同單倍型ITS序列種內(nèi)種間變異

圖2 不同單倍型psbA-trnH序列種內(nèi)種間變異

圖3 不同單倍型matK序列種內(nèi)種間變異

2.4 羅布麻及白麻屬NJ樹鑒定結(jié)果

基于ITS序列構(gòu)建的NJ樹，羅布麻、白麻與大葉白麻聚為一支(圖4)；基于psbA-trnH及matK序列構(gòu)建的NJ樹聚為兩支，羅布麻單獨(dú)為一支，而白麻與大葉白麻聚為一支(圖5、圖6)。

圖4 基于ITS序列的NJ鑒別樹，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1 000次重復(fù))

圖5 基于psbA-trnH序列的NJ鑒別樹，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1 000次重復(fù))

圖6 基于matK序列的NJ鑒別樹，在圖中顯示分支支持率(≥50%，bootstrap 1 000次重復(fù))

3 討論

3.1標(biāo)準(zhǔn)基因片段的選擇是建立物種DNA條形碼的關(guān)鍵?；诤颂求wITS序列的高度變異性及長度保守性，已被廣泛用于系統(tǒng)發(fā)育及親緣關(guān)系的研究[24]。陳士林等[25]對(duì)不同候選DNA條形碼進(jìn)行篩選，結(jié)果表明葉綠體序列psbA-trnH在物種水平和屬水平鑒定效率遠(yuǎn)高于葉綠體其他條形碼候選序列。matK基因位于葉綠體trnK基因的內(nèi)含子中，是葉綠體基因組的蛋白編碼區(qū)中進(jìn)化最快的基因之一，為種間及種下的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供了一定的價(jià)值[26-27]。因此，本研究將ITS、psbA-trnH及matK作為候選序列。

3.2DNA提取和PCR擴(kuò)增的穩(wěn)定性是DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用的前提。可從不同產(chǎn)地及不同批次的樣品中均能穩(wěn)定的獲取DNA條形碼序列是DNA條形碼應(yīng)用的基礎(chǔ)[28]，羅布麻藥用部位為葉片，與本研究樣本取材一致，有利于本研究55份實(shí)驗(yàn)樣品的DNA提取及PCR擴(kuò)增，為順利獲得ITS、psbA-trnH及matK序列奠定基礎(chǔ)。

3.3ITS鑒定結(jié)果顯示：羅布麻與白麻、大葉白麻具有親緣關(guān)系，可能是源于種間雜交或自然變異演變?yōu)椴煌姆N下等級(jí)，因此，新疆等地民間以白麻入藥具有一定依據(jù)[1，29]。羅布麻與白麻及大葉白麻的psbA-trnH及matK序列種內(nèi)最大K2P距離小于種間最小K2P距離，能準(zhǔn)確鑒定羅布麻與白麻及大葉白麻，為羅布麻藥材的準(zhǔn)確客觀鑒定提供新的技術(shù)手段，有利于藥材市場的監(jiān)測和管理。而白麻與大葉白麻的 ITS、psbA-trnH及matK序列無差異，所以，《新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)》將“羅布麻”的基原定為大葉白麻P.hendersonii值得商榷。

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MolecularSystematicsStudyofApocynumResourcesBasedonITS，psbA-trnHandmatKSequences

TANXiufang1，F(xiàn)ANCongzhao2，LIXiaojin1，2*，WANGQiang，LiYang1，XINYaxian1

(1.CollegeofPharmacy，XinjiangMedicalUniversity，Urmqi830011，China；2.XinjiangInstituteofChineseMateriaMedicaandEthnicalMateria，Urumqi830002，China)

Objective：The difference ofApocynumgenus plants were studied by molecular method to provide evidence for formulating standard of the original plants of Uyghur medicine “Lubuma”.Methods：Fifty-five samples ofApocynumvenetum，PoacynumpictumandP.hendersoniiwere amplified and bidirectionally sequenced，and the intra-and interspecific variations were compared by three DNA barcodes(ITS，psbAtrnHandmatK).Genetic distances were caculated and NJ trees were constructed based on kimura 2-parameter (K2P) model.Results：The intra-and interspecific variations of ITS sequences showed no significant differences between three species，and they clustered as one clade in the NJ trees.The intraspecific genetic distances were lower than the interspecific genetic distances betweenA.venetumand other two species，and the species ofA.venetumcould be easily distinguished from the other two species by NJ-trees.No significant difference was found betweenP.pictumandP.hendersoniion either variable sites or NJ-trees.Conclusion：It is questionable thatP.hendersoniiwas scheduled as original plant of Uyghur medicine “Lubuma” in "Uygur Medicine Standard of Xinjiang Uygur Autonomous Region" according to this research.

Apocynumvenetum；DNA barcode；original plants；ITS；psbA-trnH；matK；

2014-12-17)

烏魯木齊市科技局科技攻關(guān)項(xiàng)目(G121120004)

*

李曉瑾，研究員，研究方向：中藥資源學(xué)；Tel：(0991)2665614，E-mail：xjlxj@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.002