閆嵩，任偉超，鄭希龍，楊毅，潘勃，師玉華，孫偉*，馬偉*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所海南分所，海南 萬寧 571533；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所重慶分所，重慶 南川 408435；5.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223)

·專題·

市售白花蛇舌草藥材的DNA條形碼鑒定研究△

閆嵩1，2，任偉超1，鄭希龍3，楊毅4，潘勃5，師玉華2，孫偉2*，馬偉1*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所海南分所，海南 萬寧 571533；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 藥用植物研究所重慶分所，重慶 南川 408435；5.中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明 650223)

目的：基于ITS2序列檢測市場藥材白花蛇舌草，為白花蛇舌草藥材鑒定提供一種新的分子手段。方法：實(shí)驗(yàn)獲取白花蛇舌草及其常見混偽品基原植物ITS2序列，結(jié)合GenBank下載序列共7個物種53條序列。經(jīng)CodonCode Aligner V3.7.1拼接，利用MEGA 6.0軟件進(jìn)行變異位點(diǎn)分析，遺傳距離計算和構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)發(fā)育聚類樹。同時隨機(jī)檢測37份市場藥材白花蛇舌草，經(jīng)中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)進(jìn)行序列比對并構(gòu)建鄰接(NJ)系統(tǒng)聚類樹確定物種，鑒別真?zhèn)?。結(jié)果：白花蛇舌草基原植物ITS2序列種內(nèi)K2P平均遺傳距離遠(yuǎn)小于其與混偽品種間K2P平均遺傳距離，NJ樹結(jié)果表明白花蛇舌草基原植物可與其混偽品明顯區(qū)分；市場藥材中正品29份，偽品8份，其中半枝蓮和遠(yuǎn)志為新發(fā)現(xiàn)的偽品。結(jié)論：基于ITS2 序列DNA條形碼技術(shù)可有效準(zhǔn)確鑒定白花蛇舌草及其混偽品，為其用藥安全提供了有力保障。

白花蛇舌草；ITS2；DNA條形碼；鑒定

白花蛇舌草又名蛇舌草、矮腳白花蛇利草、蛇舌癀等，生于潮濕的田邊、溝邊、路旁和草地，分布于我國東南至西南部各地，其味苦、甘，性寒；歸心、肝、脾、大腸經(jīng)[1]。《中華人民共和國藥典》2010版一部附錄擬定其來源為茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd.)Roxb.(中國植物志為茜草科耳草屬HedyotisdiffusaWilld.)的干燥全草。白花蛇舌草具有清熱解毒、利尿消腫、活血止痛、抗菌消炎和抗腫瘤等功效[2]，其中成藥白花蛇舌草注射液已被國內(nèi)多個廠家生產(chǎn)，用于濕熱蘊(yùn)毒所致的呼吸道感染，扁桃體炎，肺炎，膽囊炎，闌尾炎，癰癤膿腫及手術(shù)后感染，亦可用于癌癥輔助治療。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)市場上白花蛇舌草常見的混偽品主要有傘房花耳草、鵝不食草、漆姑草、雀舌草、地錦草、仙桃草等，藥材形態(tài)特征有限，難以從外觀上準(zhǔn)確快速鑒定，因此白花蛇舌草偽品混用誤用現(xiàn)象比較明顯[3-5]，使得藥材質(zhì)量以及用藥安全得不到保證，因此急需一種準(zhǔn)確快速鑒定白花蛇舌草的新方法。

DNA條形碼是利用基因組中一段公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的、相對較短的DNA片段來進(jìn)行物種鑒定的一種分子診斷新技術(shù)，是近年來生物分類和鑒定的研究熱點(diǎn)[6-9]。在植物鑒定方面，Chen等[10]以藥用植物及其密切相關(guān)物種為研究對象，分析比較篩選大量樣本基因序列，結(jié)果表明ITS2表現(xiàn)突出，在物種水平的鑒定效率高達(dá)92.7%，適合于中藥材等存在DNA降解的材料，明顯優(yōu)于國際生命條形碼聯(lián)盟推薦的400-800 bp葉綠體序列rbcL和matK聯(lián)合條形碼，故將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列[11-15]。目前，該方法在羌活、赤芍、麻黃、黨參、紅景天、馬兜鈴等藥材鑒定上得到了很好的驗(yàn)證[16-21]。同時，陳士林團(tuán)隊建立了中藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(http：//www.tcmbarcode.cn)，其鑒定核心數(shù)據(jù)庫共包含數(shù)萬物種，超過十萬條序列，涵蓋《中華人民共和國藥典》2010版收錄的幾乎所有動植物藥材及其常見混偽品，同時包含日本、韓國、印度、美國和歐洲藥典95%以上的藥材。為確保樣品的準(zhǔn)確性和代表性，樣品采集盡量覆蓋藥材原產(chǎn)地、主產(chǎn)地及其主要分布區(qū)，并由國內(nèi)外權(quán)威專家采用經(jīng)典分類方法確定其基原[11]。本實(shí)驗(yàn)基于ITS2序列建立白花蛇舌草DNA條形碼鑒定方法，同時檢測全國市場藥材，驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，確保白花蛇舌草的用藥安全。

1 材料

本實(shí)驗(yàn)選用白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa、傘房花耳草Oldenlandiacorymbosa、鵝不食草Centipedaminima、漆姑草Saginajaponica、雀舌草Stellariaalsine、地錦草Euphorbiahumifusa、仙桃草Veronicaanagallis-aquatica共7個物種45份基原植物，采集于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所、重慶分所、廣西分所，中國科學(xué)院西雙版納植物園、華南植物園。憑證標(biāo)本保存于中國中醫(yī)研究院中藥研究所，并從GenBank上下載8條ITS2序列(登錄號為HQ148830，HQ148798，HQ148799，HQ148800，HQ148801，HQ148802，KJ630576，KJ630577)。詳細(xì)信息見表1，表2。

表1 基原物種信息

表2 GenBank下載序列

2 方法

2.1 DNA的提取

取白花蛇舌草及混偽品植物樣本40 mg，用高通量組織球磨儀50 Hz研磨120 s后，用植物組織DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取總DNA。期間加入700 μL DNA裂解液，56 ℃水浴過夜。

2.2 PCR擴(kuò)增及測序

植物類中藥材及其基原物種ITS2序列通用引物：正向引物：ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，正反向引物(2.5 μmol·L-1)各1ul，DNA2ul，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(經(jīng)過40個循環(huán))；最后72 ℃延伸10 min[22]。PCR產(chǎn)物取3 μL，以0.5×TAE電泳緩沖液進(jìn)行凝膠電泳，擴(kuò)增成功的產(chǎn)物送北京美吉生物醫(yī)藥科技有限公司雙向測序。

2.3 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果運(yùn)用Codoncode Aligner V3.7.1進(jìn)行校對拼接，去除引物區(qū)?；陔[馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除5.8S和28S[23]，得到ITS2序列。用軟件MEGA 6.0把所得序列進(jìn)行分析比對[24]，基于K2P模型計算遺傳距離，鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育聚類樹，采用自舉檢驗(yàn)法bootstrap重復(fù)1000次檢驗(yàn)各個分支的支持率。

3 基原物種鑒定結(jié)果分析

3.1 白花蛇舌草的種內(nèi)變異分析

白花蛇舌草ITS2序列比對后長度為214 bp，種內(nèi)存在兩條變異位點(diǎn)，位置分別為94 bp，173 bp處，分為三種單倍型，平均GC含量為66.4%，A1單倍型4條，同GenBank KT284787；A2單倍型3條，同GenBank KT284788；A3單倍型3條，同GenBank KT284791(表3)。

表3 白花蛇舌草種內(nèi)變異

3.2 白花蛇舌草及其混偽品的種內(nèi)種間遺傳距離分析

基于K2P模型計算白花蛇舌草與其混偽品K2P距離，白花蛇舌草的種內(nèi)K2P平均距離為0.0044，種內(nèi)最大K2P遺傳距離為0.0094。白花蛇舌草與其偽品傘房花耳草、鵝不食草、漆姑草、雀舌草、地錦草、仙桃草的種間最小遺傳距離分別為0.2895，0.5767，0.7429，0.6639，0.7093，0.4573，均遠(yuǎn)大于白花蛇舌草種內(nèi)最大遺傳距離，表明ITS2序列能準(zhǔn)確區(qū)分白花蛇舌草及其混偽品(表4)。

表4 白花蛇舌草種內(nèi)遺傳距離及其與混偽品的種間遺傳距離

3.3 白花蛇舌草及其混偽品的NJ樹鑒定

基于得到的53條ITS2序列，用鄰接(NJ)法構(gòu)建白花蛇舌草和其混偽品的系統(tǒng)聚類樹。從所構(gòu)建的NJ樹中可以看出，白花蛇舌草序列單獨(dú)聚為一支，混偽品物種也能單獨(dú)聚為一支，呈現(xiàn)良好的單系性且自展支持率都大于95%(圖1)。

4 市場藥材白花蛇舌草鑒定結(jié)果分析

從安徽亳州藥市，河北安國藥市，成都蓮花池藥市，哈爾濱，湖北，河南，北京，遼寧，江西藥店共收集藥材白花蛇舌草37份(編號SCBH01-SCBH37)，用上文同樣方法得到ITS2序列，并到中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)比對，鑒定結(jié)果見表5。

對37份市場藥材序列比對發(fā)現(xiàn)共有白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa29份，傘房花耳草Oldenlandiacorymbosa4份，鵝不食草Centipedaminima1份，發(fā)現(xiàn)新偽品2種，半枝蓮Scutellariabarbata2份，遠(yuǎn)志Polygalatenuifolia1份。偽品占抽樣調(diào)查的21.6%。

根據(jù)以上序列的比對結(jié)果，將37份市場藥材(包括新偽品)和前文白花蛇舌草及其混偽品基原物種的ITS2序列一起構(gòu)建NJ樹(圖2)。結(jié)果可以看出，29份藥材與白花蛇舌草基原聚成一枝，4份與傘房花耳草聚成1枝，1份與鵝不食草構(gòu)成一枝，2種新偽品也能單獨(dú)的聚成一枝，物種鑒定結(jié)果與中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果相同，表明基于ITS2 DNA條形碼技術(shù)能很好的鑒定藥材白花蛇舌草。

注：Bootstra P1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%圖1 基于ITS2序列構(gòu)建白花蛇舌草及其混偽品鄰接(NJ)樹

表5 市場藥材白花蛇舌草鑒定結(jié)果

表5(續(xù))

注：Bootstra P1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的市場藥材白花蛇舌草和已知基原物種的鄰接(NJ)樹

5 討論

DNA條形碼技術(shù)的興起及成熟，解決了傳統(tǒng)中藥鑒定方法主觀性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)[25]，一個準(zhǔn)確全面的中藥DNA條形碼數(shù)據(jù)庫建立顯得尤其重要，應(yīng)可方便快捷對中藥資源信息檢索、查詢以及物種比對鑒定，目前，陳士林團(tuán)隊已建立了全世界最大的中草藥DNA條形碼鑒定數(shù)據(jù)庫和中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)網(wǎng)站http：//www.tcmbarcode.cn，為廣大科研工作者直接應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)鑒定中藥材搭建了一個平臺。

白花蛇舌草作為傳統(tǒng)中藥材，擁有良好的藥用價值，市場及臨床需求量大，但其野生藥材資源不斷減少，家種商品不多，與其外觀形態(tài)相似的偽品又多，使得混用誤用現(xiàn)象不斷增加，嚴(yán)重影響用藥療效與安全，有關(guān)部門應(yīng)提高白花蛇舌草藥材監(jiān)管力度，確保藥材的質(zhì)量與規(guī)范化使用。雖然傳統(tǒng)方法如從植物形態(tài)、性狀、顯微方面能夠辨別真?zhèn)蝃3-5]，但對操作者的專業(yè)知識要求較高，且伴有較強(qiáng)的主觀性，本研究證實(shí)了運(yùn)用DNA條形碼技術(shù)鑒定市場藥材白花蛇舌草的可行性。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免污染，并要保證提取DNA的濃度，本實(shí)驗(yàn)涉及的7種原植物和藥材用通用引物ITS2F/3R有很好的擴(kuò)增效率，PCR電泳后均呈現(xiàn)清晰條帶。白花蛇舌草及其混偽品基原物種最近距離法和NJ樹鑒定均表明ITS2序列在物種間的鑒定能力，能將白花蛇舌草及其混偽品很好鑒定開，于此基礎(chǔ)上再對市場藥材白花蛇舌草進(jìn)行比對鑒定和結(jié)合已知基原物種序列建立NJ樹確定物種基原。37份市場藥材中正品29份，偽品8份，正品率為78.4%，需要提及的是，偽品中還檢測出兩種新偽品半枝蓮和遠(yuǎn)志，NJ樹上也能獨(dú)自聚為一枝，表現(xiàn)良好的單系性。綜上，應(yīng)用ITS2序列可以準(zhǔn)確鑒定白花蛇舌草藥材及其混偽品，且建立的白花蛇舌草DNA條形碼鑒定方法可對市售白花蛇舌草進(jìn)行鑒定。

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SurveyofCommerciallyAvailableOldenlandiadiffusaProductsUsingDNABarcoding

YANSong1，2，RENWeichao1，ZHENGXilong3，YANGYi4，PANBo5，SHIYuhua2，SUNWei2*，MAWei1*

(1.PharmacyCollege，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin150040，China；2.InstituteofChineseMateriaMedica，ChinaAcademyofChineseMedicalSciences，Beijing100700，China；3.HainanBranchofInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcadenyofMedicalSciences，Wanning571533，China；4.ChongqingBranchofInstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcadenyofMedicalSciences，Nanchuan408435，China；5.XishuangbannaTropicalBotanicalGarden，ChineseAcademyofSciences，Kunming650223，China)

Objective：To provide a new molecular method for the identification ofOldenlandiadiffusa，based on internal transcribed spacer 2 (ITS2) sequence.Methods：Combined with the sequences downloaded from GenBank，total 53 sequences ofO.diffusaand its adulterants were obtained representing total 7 species.After sequences were assembled by Codoncode Aligner V3.7.1，MEGA 6.0 software was used for analyzing mutation loci，computing the genetic distances and building neighbor-joining(NJ) phylogenetic tree.Simultaneously，37 randomO.diffusafrom markets were detected by Chinese herbal medicine DNA barcode identification system.The species were determined by NJ tree and Blast1 methods.Results：The results revealed that the intraspecific genetic distances ofO.diffusawere lower than the interspecific genetic distances betweenO.diffusaand its adulterants.The NJ tree strongly supported thatO.diffusaand its adulterants can be differentiated.29 samples ofO.diffusacollected from markets are genuine，8 samples are counterfeit.ScutellariabarbataandPolygalatenuifoliawerereportedasnewadulterants.Conclusion：The ITS2 sequences of DNA barcoding can identifyO.diffusafrom its adulterants accurately and effectively，which provide a strong guarantee for the safety of the drug.

Oldenlandiadiffusa；ITS2；DNA barcoding；identification

2015-08-06)

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201004079，201404718)；重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項(xiàng)(2014ZX09304307001)

*

馬偉，研究員，研究方向：藥用植物生物工程；E-mail：mawei@hljucm.net； 孫偉，助理研究員，研究方向：中藥資源與分子鑒定；E-mail：wsun@icmm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.10.005