賈星遠(yuǎn)

(河南中醫(yī)院第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

·中藥農(nóng)業(yè)·

不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)及其次生代謝產(chǎn)物的影響

賈星遠(yuǎn)*

(河南中醫(yī)院第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

目的：研究不同激素對冬凌草花瓣愈傷誘導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物含量的影響。方法：以冬凌草花瓣為外植體，在1/2 MS附加不同激素配比的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，HPLC法測定冬凌草甲素、乙素的含量，研究不同處理對愈傷組織誘導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果：當(dāng)NAA的濃度過高時(shí)將會引起冬凌草花瓣愈傷組織的褐化。在一定濃度范圍的6-BA可以促進(jìn)冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的生物合成。1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1為冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基。結(jié)論：不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)及冬凌草乙素的含量影響不同，為進(jìn)一步研究冬凌草愈傷組織的培養(yǎng)提供了依據(jù)。

冬凌草；花瓣；愈傷組織；激素；甲素；乙素

冬凌草為唇形科香茶菜屬多年生草本或亞灌木植物碎米椏Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara.的干燥的上部分。碎米椏產(chǎn)于我國河南、山西、貴州、河北等地。具有清熱解毒、活血止痛等功效，同時(shí)對治療食管癌、結(jié)腸癌均有一定療效[1]。研究表明冬凌草中的主要抗癌、抗菌活性成分為二萜類化合物(冬凌草甲素、冬凌草乙素)[2]、迷迭香酸。

目前國內(nèi)外關(guān)于冬凌草葉片愈傷組織的誘導(dǎo)及分化研究較多[3-5]，但對其花瓣組織誘導(dǎo)的研究未見報(bào)道。不同激素對愈傷組織的誘導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物含量有不同的作用，如不同激素對白及愈傷組織總酚含量的影響[6]中，2，4-D促進(jìn)白及愈傷組織褐化。因此通過添加不同配比激素促進(jìn)冬凌草花瓣愈傷組織的形成及其次生代謝產(chǎn)物合成，為冬凌草組織培養(yǎng)快繁體系的建立提供新的途徑。此外，植物愈傷組織的誘導(dǎo)是進(jìn)一步研究再生植株的必要步驟以及建立植物細(xì)胞懸浮系的基礎(chǔ)，通過正交試驗(yàn)法研究不同激素組合對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物合成的影響，為冬凌草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)材料的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)冬凌草無菌苗花瓣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同配比激素條件下冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo) 將冬凌草無菌苗花瓣剪成0.2 cm×0.2 cm大小塊狀，分別接種于1/2 MS加不同激素配比的培養(yǎng)基中(如表1所示)，在光照12 h·d-1、(25±1) ℃、無菌條件下培養(yǎng)。第20 d統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率，褐化率。

表1 不同激素配比 /mg·L-1

1.2.2 冬凌草有效成分含量的測定 第20 d，取出不同激素配比條件下得到的愈傷組織，稱重后放置于烘箱中，80 ℃烘至恒重，用研缽研成粉末，備用。采用HPLC法，測定冬凌草甲素、乙素含量(干重含量)，具體提取、測定方法如下。

1.2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取0.10 g的冬凌草愈傷組織粉末，置于100 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL的甲醇，稱重，靜置30 min，超聲30 min后放置室溫，補(bǔ)足重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得，作為供試樣品測定冬凌草甲素含量[7]，每個(gè)樣品重復(fù)3次。精密稱取0.10 g的冬凌草愈傷組織粉末，置于100 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL的丙酮，稱重，靜置30 min，水浴回流90 min后放置室溫，補(bǔ)足重量；搖勻，過濾，吸取過濾液20 mL，水浴蒸干，用甲醇定容于10 mL容量瓶中；搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得，作為供試樣品測定冬凌草乙素的含量[8]，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.2.2 色譜條件的選擇 Waters e2695，Waters 2489紫外檢測器；色譜柱為Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；冬凌草甲素流動(dòng)相∶甲醇-水(55∶45)，冬凌草乙素流動(dòng)相∶甲醇-0.5%磷酸水溶液(51∶49)；檢測波長為238 nm，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)的影響

冬凌草花瓣接種于不同激素組合的培養(yǎng)基上，第三天花瓣向上卷曲并開始長大，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長花瓣越長越大，第七天的部分花瓣變成透明狀態(tài)，第十二天部分愈傷組織開始形成，第十七天不同激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但不同激素組合對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)及褐化作用不同(見表2)。

表2 不同激素配比對冬凌草愈傷組織誘導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物的影響

由表2可以得出不同激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)率差異性不顯著，將花瓣接種到上述9種培養(yǎng)基中后，冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)率在60%-100%之間，6號誘導(dǎo)率為60.00%，相對較低，其中4、5、9號誘導(dǎo)率最高為100.00%。其他誘導(dǎo)率在75%-90%之間。但是不同激素配比條件下所誘導(dǎo)的冬凌草愈傷組織褐化現(xiàn)象差異顯著。上述結(jié)果表明不同激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草甲素含量為0 mg·g-1。

通過SPSS分析軟件對上述結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果如表3。

表3 不同激素對冬凌草花瓣愈傷誘導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物影響的相關(guān)性分析

注：表中*表示顯著相關(guān)，P<0.05。

由表3可以得出冬凌草花瓣愈傷組織的誘導(dǎo)與6-BA、2，4-D成正相關(guān)，與NAA成負(fù)相關(guān)，但是相關(guān)性不顯著。NAA與冬凌草花瓣愈傷組織的褐化成顯著的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.788(P<0.05)，上述結(jié)果表明NAA是冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)較為重要的一種激素，當(dāng)NAA的濃度過高時(shí)將會引起冬凌草花瓣愈傷組織的褐化。6-BA與冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的生物合成成正相關(guān)相關(guān)系數(shù)為0.684*(P<0.05)，隨著6-BA濃度增加愈傷組織中冬凌草乙素的含量相對提高，當(dāng)其濃度為2 mg·L-1時(shí)濃度達(dá)到最高，若再增加6-BA 的濃度愈傷組織中冬凌草乙素的變化有待進(jìn)一步研究。

3 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織培養(yǎng)的方法研究了不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NAA是冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)較為重要的一種激素，當(dāng)NAA的濃度過高時(shí)將會引起冬凌草花瓣愈傷組織的褐化。6-BA可以在一定濃度范圍內(nèi)促進(jìn)冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的生物合成，但其濃度超過2 mg·L-1以后，若再增加6-BA冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的變化有待進(jìn)一步研究。上述結(jié)果中9號激素條件下冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)率為100.00%，褐化率為0.00%，且冬凌草乙素含量相對較高，綜合考慮將9號激素條件作為冬凌草花瓣愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件選擇。9種激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草甲素的含量均為0 mg·L-1。故不同激素均不能刺激冬凌草甲素的生物合成。與冬凌草組織培養(yǎng)中主要次生代謝產(chǎn)物積累動(dòng)態(tài)的研究結(jié)果相同[9]，培養(yǎng)過程中隨著細(xì)胞脫分化的進(jìn)行冬凌草甲素含量逐漸降低，在細(xì)胞分化初期、芽分化初期含量為零，隨著植物器官的再生，冬凌草甲素含量逐漸上升，這說明冬凌草甲素的生物合成可能與冬凌草植株內(nèi)特定的組織或器官有關(guān)，而愈傷組織細(xì)胞往往缺少特定組織或器官，使得其次生代謝產(chǎn)物一冬凌草甲素的合成不能夠進(jìn)行。冬凌草植株再生過程中冬凌草甲素積累機(jī)制的研究表明[10]，冬凌草培養(yǎng)物內(nèi)葉綠素、丙酮酸的含量、可溶性蛋白與冬凌草甲素積累有相互促進(jìn)的關(guān)系，冬凌草內(nèi)主要次生代謝產(chǎn)物冬凌草甲素為二萜類化合物，該代謝產(chǎn)物的形成是以光合產(chǎn)物為基礎(chǔ)，冬凌草愈傷時(shí)期不能進(jìn)行光合作用故冬凌草甲素的生物合成受到限制。大量研究表明，萜類物質(zhì)生物合成在植物發(fā)育過程中由于控制時(shí)間和地點(diǎn)的不同使這一過程的調(diào)控變得較為復(fù)雜，總的來說可分為空間調(diào)控和階段調(diào)控[11]。階段調(diào)控主要指萜類化合物的產(chǎn)生與植物的發(fā)育過程有密切的相關(guān)性。如藥用植物青蒿中有效成分青蒿素的形成、積累及分布不僅具有較強(qiáng)的組織特異性，而且與植株的生長發(fā)育(尤其是開花)存在著一定的相關(guān)性。辣椒中的辣椒素只有在生殖生長的后期才能在果皮中合成并積累[12]。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究研究冬凌草愈傷組織的培養(yǎng)提供了依據(jù)。

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EffectsofDifferentPhytohormoneonCallusTissueInductionofRabdosiarubescens(Hemsl.)HaraPetalandtheAccumulationofMainSecondaryMetabolites

JIAXingyuan*

(HenanProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450000，China)

Objective：To study the effects of different phytohormone on callus tissue induction ofRabdosiarubescenspetal and the accumulated of main secondary metabolites.Methods：WithR.rubescenspetals as explant，the callus was induced on 1/2 MS medium with different phytohormone combination.HPLC method was used for the determination of oridonin，ponicidin content.The effects of different treatments on callus tissue induction and the accumulated of main secondary metabolites were studied.Results：NAA is an important phytohormone，high concentrated NAA easily led to callus browning.6-BA can promote the synthesis of ponicidin of callus tissue in the certain concentration range.The best medium of inducing callus was 1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1.Conclusion：Each phytohormone had different efferent on callus tissue induction and the accumulated of ponicidin.The research provides reference for further studies on the callus tissue culture ofR.rubescens.

Rabdosiarubescens；petal；callus tissue；phytohormone；oridonin；ponicidin

2014-12-19)

*

賈星遠(yuǎn)，初級中藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制與配伍研究；E-mail:745672523@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.017