王 偉，丁 爽，龔美源，李娜娜，燕迪迪，倪凱園，郭建成, 張 旗

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001 3)省部共建食管癌防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 4)鄭州大學(xué)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

食管癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居我國(guó)癌癥死因的第4位[1]。食管癌發(fā)病具有明顯的地區(qū)特異性，高發(fā)區(qū)域?yàn)槲覈?guó)太行山南部的河南、山西和河北三省交界地區(qū)及廣東的潮汕地區(qū)。盡管食管癌綜合治療不斷發(fā)展，但其5 a生存率仍不足20%[2]。因此，開(kāi)發(fā)新型食管癌治療藥物是臨床研究的迫切需要和重要方向之一。冬凌草是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，臨床實(shí)踐顯示其對(duì)多種惡性腫瘤治療有效，尤其對(duì)肺癌等多種常見(jiàn)腫瘤的抑瘤率高達(dá)41%。冬凌草對(duì)我國(guó)北方發(fā)病率較高的食管癌和胃癌尤為敏感[3]，冬凌草甲素是冬凌草抗癌的主要活性成分[4]。

為進(jìn)一步闡明冬凌草甲素抗食管癌作用可能的分子機(jī)制，我們運(yùn)用了全轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)(RNA-seq)分析冬凌草甲素處理4 h后的食管癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的變化，探討冬凌草甲素抗食管癌的潛在分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑冬凌草甲素(批號(hào)T12D7F26645)分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%，購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。DMSO購(gòu)自Solarbio公司，MTT購(gòu)自Amresco公司，F(xiàn)ITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit購(gòu)于美國(guó)Illumina公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR036A)由日本TaKaRa公司提供，SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司。

1.2 冬凌草甲素對(duì)EC109、TE1細(xì)胞增殖和凋亡影響的檢測(cè)

1.2.1MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109和TE1細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按5 000個(gè)/mL的密度分別接種于96孔板，每孔100 μL 細(xì)胞懸液。常規(guī)培養(yǎng)12 h后，棄培養(yǎng)基，分別加入0、10、20、40、80、160 μmol/L冬凌草甲素，每孔200 μL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，37 ℃避光孵育4 h，取出96孔板，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶物充分溶解，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)A值/對(duì)照A值) ×100%。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109和TE1 細(xì)胞，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，按4×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后棄原培養(yǎng)基，每孔分別加入冬凌草甲素終濃度為0、10、20和40 μmol/L的培養(yǎng)基2 mL培養(yǎng)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后用2.5 g/L胰蛋白酶(不含EDTA)消化細(xì)胞，用PBS洗滌2次后(1 000 r/min，5 min)，加入500 μL Binding buffer懸浮細(xì)胞，再加入Annexin V和PI各5 μL混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 RNA-seq建庫(kù)、測(cè)序分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板，過(guò)夜貼壁后，加入30 μmol/L的冬凌草甲素。4 h后按照試劑盒說(shuō)明提取總RNA，按照Illumina鏈特異RNA文庫(kù)試劑盒構(gòu)建RNA文庫(kù)。取2 μg RNA，用PolyT磁珠對(duì)mRNA富集，片段化后進(jìn)行第一鏈和第二鏈cDNA合成，然后末端加A，并加上特異性標(biāo)簽(index)。對(duì)文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，在Illumina Hiseq4000平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：首先使用FastQC和Qualimap軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，根據(jù)FastQC結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，過(guò)濾掉低質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)以及比對(duì)到核糖體RNA的讀段(reads)?；蚪M比對(duì)及后續(xù)處理步驟參考“A survey of best practices for RNA-seq data analysis”進(jìn)行。使用STAR軟件將質(zhì)量合格的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類參考基因組(GRCh37)上，RNA-seq序列的比對(duì)用于鑒定表達(dá)的基因及其定量，并有助于發(fā)現(xiàn)可變剪切和新的轉(zhuǎn)錄本。隨后分別使用Salmon軟件和FeatureCounts軟件對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量，得到基因表達(dá)的counts數(shù)據(jù)和TPM值，用于后續(xù)的差異表達(dá)基因分析等。采用BcbioRNA-seq R包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0分析。不同濃度冬凌草甲素處理不同時(shí)間對(duì)EC109和TE1細(xì)胞抑制率的影響采用6×3析因設(shè)計(jì)的方差分析，不同濃度冬凌草甲素對(duì)EC109和TE1細(xì)胞凋亡的影響采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 冬凌草甲素對(duì)EC109和TE1細(xì)胞增殖的影響冬凌草甲素對(duì)EC109和TE1細(xì)胞的增殖均有抑制作用，呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 不同濃度冬凌草甲素作用不同時(shí)間對(duì)EC109細(xì)胞增殖抑制率的影響(n=3) %

表2 不同濃度冬凌草甲素作用不同時(shí)間對(duì)TE1細(xì)胞增殖抑制率的影響(n=3) %

2.2 冬凌草甲素對(duì)EC109和TE1細(xì)胞凋亡的影響冬凌草甲素可促進(jìn)EC109和TE1細(xì)胞凋亡，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同濃度冬凌草甲素對(duì)EC109和TE1細(xì)胞凋亡率的影響(n=3) %

2.3 基因差異表達(dá)分析結(jié)果見(jiàn)圖1。在TE1細(xì)胞中冬凌草甲素可使2 023個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 642個(gè)基因下調(diào)；而在EC109細(xì)胞中冬凌草甲素可使463個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，419個(gè)基因下調(diào)；其中，共同上調(diào)的基因?yàn)?84個(gè)，共同下調(diào)的基因?yàn)?76個(gè)。

上:上調(diào)基因；下:下調(diào)基因

2.4 冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化結(jié)果見(jiàn)圖2、3。RNA-seq結(jié)果顯示，冬凌草甲素可以誘導(dǎo)谷胱甘肽合成和再生相關(guān)基因以及ROS相關(guān)的SLC7A11、TRIM16、TXNRD1、SRXN1、GCLM、GCLC、SLC3A2 以及熱激反應(yīng)基因HSPA1A、HSPA1B、HSPH1、BAG3、 DNAJB1、 HSPA8、 HSP90AA1、DNAJA1和DNAJA4表達(dá)升高。

圖2 冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化的散點(diǎn)圖

圖3 冬凌草甲素誘導(dǎo)EC109和TE1細(xì)胞的差異基因熱圖

2.5 冬凌草甲素誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組變化的GO聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖4、5。GO聚類分析顯示，差異表達(dá)基因的功能為熱激反應(yīng)基因、蛋白錯(cuò)誤折疊相關(guān)基因、神經(jīng)投射發(fā)生基因。其中HSP90AB1和HSP90AA1在這三類功能基因中發(fā)揮重要作用。

圖4 冬凌草甲素誘導(dǎo)TE-1和EC109共同上調(diào)基因的GO聚類分析柱狀圖

圖5 冬凌草甲素誘導(dǎo)TE-1和EC109共同上調(diào)基因的GO聚類分析圖

3 討論

冬凌草甲素具有明確的抗腫瘤作用，但由于其作用的分子機(jī)制尚未完全闡明，限制了冬凌草甲素這一類化合物在臨床中進(jìn)一步應(yīng)用。近年來(lái)，隨著分子藥理技術(shù)的不斷發(fā)展，冬凌草甲素相關(guān)的抗腫瘤分子靶點(diǎn)變得越來(lái)越明晰。

冬凌草甲素作用的分子靶點(diǎn)為HSP70且它能直接和HSP70半胱氨酸結(jié)合來(lái)抑制HSP70活性[5]。He等[6]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能直接與NLRP3半胱氨酸酸的巰基結(jié)合，通過(guò)NLRP3來(lái)抑制炎癥反應(yīng)。Song等[7]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能抑制AKT活性。Sechet等[8]發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能激活EFGR。除此之外，研究[9-10]認(rèn)為冬凌草甲素作用的分子靶向信號(hào)通路分別為NF-κB和mTOR等。冬凌草甲素對(duì)多個(gè)蛋白半胱氨酸上的巰基有反應(yīng)活性，而且冬凌草甲素對(duì)多個(gè)細(xì)胞信號(hào)通路均有抑制作用，為了從整體水平探索冬凌草甲素抗腫瘤活性的分子機(jī)制，作者通過(guò)組學(xué)分析來(lái)闡明冬凌草甲素抗腫瘤作用的潛在分子靶點(diǎn)。

RNA-seq是一項(xiàng)基于二代測(cè)序技術(shù)的全新分析技術(shù)，其基本原理是對(duì)轉(zhuǎn)錄組RNA進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，通過(guò)大數(shù)據(jù)分析對(duì)全部的RNA進(jìn)行定性和定量分析。這一技術(shù)顯著優(yōu)于傳統(tǒng)芯片技術(shù)，在定性和定量方面均具有巨大優(yōu)勢(shì)。由于轉(zhuǎn)錄因子HSF1調(diào)控HSPA1A、HSPA1B、BAG3、HSPH1、DNAJB1、HSPA8、HSP90AA1、DNAJA4和DNAJA1等基因表達(dá)水平，冬凌草甲素處理后上述基因表達(dá)升高，提示冬凌草甲素可通過(guò)激活HSF1發(fā)揮作用。在正常情況下，HSP70與HSF1結(jié)合后可抑制HSF1的轉(zhuǎn)錄活性。而冬凌草甲素與HSP70結(jié)合使得HSF1脫抑制，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性顯著增高[11]。因此，我們推測(cè)HSP70可能是冬凌草素作用的重要分子靶點(diǎn)。冬凌草甲素還可與多種蛋白的半胱氨酸結(jié)合，從而造成蛋白錯(cuò)誤折疊和誘發(fā)熱激反應(yīng)。此外，冬凌草甲素誘發(fā)GSH生成系統(tǒng)中多種酶和蛋白的mRNA水平升高，提示冬凌草甲素可能是通過(guò)耗竭細(xì)胞內(nèi)的GSH來(lái)發(fā)揮作用。研究[11]也證實(shí)，GSH能完全阻斷冬凌草甲素的抗癌活性，而GSSG則沒(méi)有此作用，表明GSH中的巰基可能直接參與了冬凌草甲素的抗癌作用。

綜上所述，冬凌草甲素作用后可導(dǎo)致食管癌細(xì)胞內(nèi)GSH密切相關(guān)基因SLC7A11、TRIM16、TXNRD1、SRXN1、GCLM、GCLC、SLC3A2水平升高，細(xì)胞內(nèi)的GSH耗竭可能是冬凌草甲素抗食管癌作用最為重要的分子機(jī)制之一。