李曾一，王 松，高 宛，林玉玲

1)南陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南南陽 473000 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450052

糖尿病腎病是一種臨床上常見的糖尿病并發(fā)癥，遺傳學因素、氧化應激等是誘發(fā)糖尿病腎病的主要因素[1]。有研究[2]表明，腎小管上皮細胞損傷是糖尿病腎病進展的關(guān)鍵，高血糖能夠誘導腎小管上皮細胞凋亡，促進細胞氧化損傷，進而造成腎小管組織功能異常。線粒體動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)是一種與線粒體分裂相關(guān)的蛋白，在人類新生兒發(fā)育中具有重要作用[3-4]。有研究[5-6]顯示，糖尿病腎病中Drp1表達水平異常升高，Drp1參與阿德福韋誘發(fā)的腎小管上皮細胞功能損傷。本次實驗以腎小管上皮細胞HK-2為研究對象，探討Drp1在高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料HK-2細胞購自美國ATCC公司。丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量檢測試劑盒購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所，炎性小體NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)抗體、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)檢測試劑盒購自上海一研生物科技有限公司，Drp1抗體購自美國Abcam公司，活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購自美國CTS公司，SYBR Green PCR試劑盒購自德國QIAGEN公司，Trizol試劑購自上海將來實業(yè)股份有限公司，Drp1 siRNA慢病毒和陰性對照慢病毒由山東解螺旋生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 高糖對腎小管上皮細胞中Drp1表達的影響HK-2細胞分別培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5、30.0 mmol/L的培養(yǎng)液中，記為正常對照組、高糖組，培養(yǎng)24 h后使用Real-time PCR和Western blot法檢測細胞中Drp1 mRNA和蛋白的表達水平。

Real-time PCR：用Trizol法提取細胞總RNA。取5 μg總RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃保存。PCR引物由南京金斯瑞公司合成，引物序列：GAPDH上游引物5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTT-3’，下游引物 5’-ATCGCCCCACTTGATTTTG-3’；Drp1上游引物 5’-TGCTGTGGACTTGAGTTGGG-3’，下游引物5’-GGCTGGGTTTGTCGGTGTT-3’。按照SYBR Green PCR試劑盒說明步驟進行擴增。反應體系：2.0 μL cDNA，上、下游引物各1.0 μL，12.5 μL SYBR Green PCR Master Mix，8.5 μL dH2O。反應程序：90 ℃ 30 s;95 ℃3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。讀取Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果用2-ΔΔCt法計算。實驗重復3次。

Western blot：在細胞中分別添加含PMSF的RIPA裂解液，振蕩混勻，在冰上充分裂解，4 ℃12 000 ×g離心10 min，用移液槍把上清液轉(zhuǎn)移到EP管中，-20 ℃保存。采用BCA法對蛋白樣品進行定量檢測。蛋白樣品中添加上樣緩沖液并煮沸變性，每個泳道上樣30 μg，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜以50 g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加Drp1抗體(1∶600稀釋)，室溫下反應2 h，加1∶3 000稀釋的二抗，室溫結(jié)合2 h，ECL法發(fā)光。Image J分析條帶的灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.3 Drp1 siRNA干擾效果檢測將HK-2細胞接種于24孔板，每孔接種2×105個細胞。顯微鏡下觀察細胞匯合度為40%～50%時，每孔添加1 mL Drp1 siRNA慢病毒液或陰性對照慢病毒液(MOI=20)，孵育12 h后取出培養(yǎng)板，加入新的培養(yǎng)液。3 d后，用Puromycin篩選3周，挑選抗性細胞擴大培養(yǎng)。分別將穩(wěn)定感染Drp1 siRNA慢病毒、陰性對照慢病毒的細胞置于高糖(葡萄糖濃度為30.0 mmol/L)細胞培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，記為Lv-si Drp1+高糖組和Lv-NC+高糖組，未感染僅以高糖細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細胞為高糖組。用Real-time PCR和Western blot法檢測細胞中Drp1 mRNA和蛋白的表達，以驗證干擾效果，步驟同1.2。

1.4 Drp1 siRNA干擾對高糖環(huán)境下HK-2細胞凋亡和氧化應激、凋亡及炎癥因子表達的影響將穩(wěn)定感染Drp1 siRNA慢病毒或陰性對照慢病毒的HK-2細胞用高糖(葡萄糖濃度30.0 mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為Lv-si Drp1+高糖組和Lv-NC+高糖組；未感染細胞分別用葡萄糖濃度為5.5、30.0 mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為正常對照組、高糖組。

培養(yǎng)24 h后，收集上述4組細胞，用1×PBS洗滌2次，添加150 μL緩沖液后先加10 μL Annexin V-FITC，再加5 μL PI，混勻，室溫、避光反應15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

收集上述4組細胞培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液上清，按照硫代巴比妥酸法檢測MDA水平，用黃嘌呤氧化法檢測SOD活性，用二硝基苯肼比色法檢測LDH水平，用ELISA法檢測IL-1β水平，步驟均參照試劑盒操作說明進行。 實驗重復3次。

培養(yǎng)24 h后收集上述4組細胞，用Western blot法檢測細胞中Cleaved Caspase-3和NLRP3蛋白的表達水平，步驟同1.2，一抗稀釋度均為1∶600。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗比較正常對照組與高糖組 Drp1 mRNA和蛋白表達水平的差異；采用單因素方差分析比較高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組Drp1 mRNA和蛋白表達水平的差異；正常對照組、高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組細胞凋亡率，SOD、MDA、LDH及IL-1β分泌量，以及細胞中Cleaved Caspase-3和NLRP3蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高糖對HK-2細胞中Drp1表達的影響結(jié)果見圖1和表1。與正常對照組比較，高糖組細胞中Drp1 mRNA和蛋白表達水平升高。

1：正常對照組；2：高糖組

表1 2組細胞中Drp1 mRNA和蛋白表達水平的比較(n=3)

2.2 Drp1 siRNA的干擾效果結(jié)果見圖2和表2。與其他2組比較，Lv-si Drp1+高糖組細胞中Drp1 mRNA和蛋白表達水平降低。

1～3：分別為高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組

表2 3組細胞中Drp1 mRNA和蛋白表達水平的比較(n=3)

2.3 4組HK-2細胞凋亡和氧化應激、凋亡及炎癥因子表達的比較結(jié)果見圖3，表3、4。與正常對照組比較，高糖組和Lv-NC+高糖組細胞凋亡率升高，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平升高(圖3A)，MDA、LDH分泌增加，SOD分泌減少，IL-1β分泌增加，細胞中NLRP3蛋白表達水平升高；與高糖組和Lv-NC+高糖組比較，Lv-si Drp1+高糖組細胞凋亡率降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達水平降低，MDA、LDH分泌減少，SOD分泌增加，細胞中NLRP3蛋白表達水平降低(圖3B)，IL-1β分泌減少。

1～4:分別為正常對照組、高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組

表3 4組細胞的凋亡率及Cleaved Caspase-3、NLRP3蛋白表達水平的比較(n=3)

表4 4組細胞SOD、MDA、LDH、IL-1β分泌量的比較(n=3)

3 討論

高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷模型是十分常見的糖尿病腎病細胞體外模型[7-9]。Caspase-3是Caspase凋亡反應的下游執(zhí)行因子，其只有被活化后才可以發(fā)揮促進細胞凋亡的作用[10]。本實驗表明，高糖刺激后腎小管上皮細胞凋亡率升高，細胞中活化的Caspase-3蛋白表達水平升高，說明構(gòu)建了高糖腎小管上皮細胞損傷體外模型。

Drp1在多種生物體中存在且高度保守。人類Drp1基因定位在12號染色體上。Drp1蛋白由699個氨基酸組成，含有保守的中間結(jié)構(gòu)域、裝配域及含GTP酶結(jié)構(gòu)的N端，多以多聚體的形式存在于胞漿中，參與細胞運輸、細胞凋亡等過程[11-13]。野生型Drp1可以促進高糖條件下胰島β細胞凋亡，誘導細胞氧化損傷；高糖刺激后人動脈內(nèi)皮細胞中Drp1表達上調(diào)，Drp1沉默可以改善高糖環(huán)境下內(nèi)皮細胞線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高一氧化氮利用度[14-15]。研究[5,16]顯示，Drp1在糖尿病腎病小鼠腎組織內(nèi)表達上調(diào)，白藜蘆醇干預可以降低腎組織內(nèi)Drp1的表達，改善糖尿病腎病腎組織損傷。本實驗表明，高糖刺激后腎小管上皮細胞Drp1表達增強，說明Drp1有可能與高糖誘導的腎小管上皮細胞損傷有關(guān)。

高糖刺激后的腎小管上皮細胞發(fā)生氧化損傷以及炎性損傷是糖尿病腎病發(fā)生的重要機制；正常情況下細胞中氧化還原平衡的維持與細胞內(nèi)抗氧化酶的活性有關(guān)，SOD是氧自由基清除劑，其活性降低能夠直接導致細胞中氧自由基的積累，引起細胞內(nèi)的脂質(zhì)過氧化，生成MDA。由于脂質(zhì)是細胞膜的主要組成部分，過量的氧自由基通過這種作用破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，促使細胞釋放LDH等物質(zhì)至細胞外[17-20]。此外，氧化應激往往伴隨有炎癥反應，NLRP3是廣泛存在于細胞內(nèi)的炎性小體，可被細胞內(nèi)氧自由基激活，促進炎癥因子IL-1β的表達，從而誘導細胞炎性損傷[21-22]。本實驗結(jié)果表明，下調(diào)Drp1可以抑制高糖刺激的腎小管上皮細胞凋亡，提高SOD的分泌，減少MDA、LDH和IL-1β的分泌，下調(diào)細胞中NLRP3蛋白表達，說明下調(diào)Drp1能夠減輕高糖刺激下的腎小管上皮細胞損傷，其作用機制可能與抑制氧化應激和炎癥反應有關(guān)。

總之，下調(diào)Drp1能夠減少腎小管上皮細胞凋亡，減輕高糖誘導的氧化應激反應和細胞炎性損傷，這對于研究糖尿病腎病具體的分子機制有重要意義，后續(xù)實驗會在原代腎小管上皮細胞及體內(nèi)進行驗證。