王婷 劉宗明

(十堰市人民醫(yī)院 1富康社區(qū)醫(yī)院糖尿病科，湖北 十堰 442000；2內(nèi)分泌科)

目前糖尿病的各種并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因，而糖尿病腎病(DN)是糖尿病的微血管慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜仍未完全闡明可能與糖代謝紊亂、炎癥反應(yīng)等相關(guān)〔1〕。lncRNA可與miRNA、mRNA或蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，且lncRNA參與DN的發(fā)生發(fā)展，可作為其診斷和預(yù)后的新型潛在生物標(biāo)志物〔2〕。如LncRNA MALAT1在DN中表達(dá)失調(diào)，并通過與β-連環(huán)蛋白的相互作用參與高葡萄糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷〔3〕；LncRNA ENSMUST00000147869保護(hù)腎小球系膜細(xì)胞免受DN誘導(dǎo)的增殖和纖維化〔4〕；而尚未見lncRNA X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本基因(lncRNA XIST)在DN中的相關(guān)研究。研究表明miRNA在DN的發(fā)生及發(fā)展過程中起重要作用〔5〕。miR-30b-5p在小鼠DN模型中下調(diào)表達(dá)，過表達(dá)調(diào)控高糖誘導(dǎo)HK2細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔6〕。但miR-30b-5p在DN中的作用機(jī)制尚不清楚，本文旨在研究lncRNA XIST在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)及其對高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷的作用，且lncRNA XIST是否通過靶向調(diào)控miR-30b-5p的表達(dá)影響高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 腎小管上皮細(xì)胞HK-2購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自日本Takara公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒購自上海聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；蛋白提取試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組 腎小管上皮細(xì)胞HK-2常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期細(xì)胞消化后，接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后吸取原培養(yǎng)液，分別換成5.5 mmol/L(對照組)和25.0 mmol/L(高糖組)葡萄糖的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集備用。轉(zhuǎn)染組：取對數(shù)生長期HK-2細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基同步化12 h；將si-NC、si-XIST、miR-NC、miR-30b-5p、si-XIST+anti-miR-NC、si-XIST+anti-miR-30b-5p轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞培養(yǎng)24 h，后用25.0 mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)液刺激培養(yǎng)48 h ，分別記為高糖+si-NC組、高糖+si-XIST組、高糖+miR-NC組、高糖+anti-miR-NC組、高糖+miR-30b-5p組高糖+si-XIST+anti-miR-NC組、高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p組。

1.2.2qRT-PCR分析miR-30b-5p及XIST mRNA表達(dá)水平 用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，按照熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算。

1.2.3Western印跡檢測蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，上樣60 μg后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5 %脫脂牛奶室溫封閉90 min，分別加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜；再加入相對應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，暗室曝光顯影、定影，分析蛋白條帶吸光度，計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.2.4ELISA檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6的表達(dá) 取各組細(xì)胞上清液，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 離心收集細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)，避光孵育15 min；上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建XIST 3′UTR野生型和突變型熒光素酶表達(dá)載體(WT-XIST和MUT-XIST)，將其分別與miR-NC和miR-30b-5p共轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，依據(jù)說明書要求檢測，以熒光素酶活性和Renilla活性的比值作為細(xì)胞熒光素酶相對活性。將pcDNA、pcDNA-XIST、si-NC、si-XIST轉(zhuǎn)染至HK-2細(xì)胞，qRT-PCR分析miR-30b-5p表達(dá)水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1高糖對腎小管上皮細(xì)胞HK-2中l(wèi)ncRNA XIST和miR-30b-5p表達(dá)的影響 相較于對照組，高糖組腎小管上皮細(xì)胞HK-2中miR-30b-5p表達(dá)水平顯著降低，XIST mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 高糖對腎小管上皮細(xì)胞HK-2中l(wèi)ncRNA XIST和miR-30b-5p表達(dá)的影響

2.2下調(diào)XIST表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 相較于對照組，高糖組腎小管上皮細(xì)胞HK-2中XIST mRNA的表達(dá)水平顯著升高，相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組腎小管上皮細(xì)胞HK-2中XIST mRNA的表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。相較于對照組，高糖組腎小管上皮細(xì)胞HK-2中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高，相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組腎小管上皮細(xì)胞HK-2中IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。見表2?？梢?，下調(diào)XIST表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。

表2 下調(diào)XIST表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

2.3下調(diào)XIST表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 相較于對照組，高糖組Bax表達(dá)水平顯著升高，而Bcl-2表達(dá)水平顯著降低；相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組Bax表達(dá)水平顯著降低，而Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。相較于對照組，高糖組HK-2細(xì)胞凋亡率顯著升高，相較于高糖+si-NC組，高糖+si-XIST組HK-2細(xì)胞凋亡率顯著降低(均P<0.05)。見圖1、圖2、表3?？梢娤抡{(diào)XIST表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡。

1～4:對照組，高糖組，高糖+si-NC組,高糖+si-NC組圖1 Western印跡檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖2 下調(diào)XIST對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

表3 下調(diào)XIST對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.4miR-30b-5p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響 相較于高糖+miR-NC組，高糖+miR-30b-5p組Bax表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；miR-30b-5p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表4，圖3?？梢妋iR-30b-5p過表達(dá)抑制高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放，改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

表4 miR-30b-5p過表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的影響

圖3 Western印跡檢測各組Bcl-2、Bax的表達(dá)

2.5lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-30b-5p的表達(dá) TargetScan預(yù)測到XIST與miR-30b-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。miR-30b-5p與WT-XIST共轉(zhuǎn)染后HK-2細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而miR-30b-5p與MUT-XIST共轉(zhuǎn)染后HK-2細(xì)胞的熒光素酶活性差異不顯著。見表5。相較于pcDNA組miR-30b-5p水平(1.02±0.09)，pcDNA-XIST組顯著降低(P<0.05)；而相較于si-NC組miR-30b-5p水平(1.01±0.08)，si-XIST組(2.76±0.27)顯著升高(P<0.05)?？梢奨IST靶向調(diào)控miR-30b-5p的表達(dá)。

圖4 XIST含有與miR-30b-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.6抑制miR-30b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)XIST表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用 相較于高糖+si-XIST+anti-miR-NC組，高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p組Bax表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；miR-30b-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；IL-6、TNF-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖5，表6?？梢妋iR-30b-5p抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)XIST表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和炎癥因子的釋放的抑制作用，逆轉(zhuǎn)了下調(diào)XIST表達(dá)改善高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

1，2:高糖+si-XIST+anti-miR-NC組,高糖+si-XIST+anti-miR-30b-5p組圖5 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 抑制miR-30b-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了下調(diào)XIST表達(dá)對高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷的作用

3 討 論

DN是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥，其發(fā)病率逐年升高，已成為危害人類的重大疾病〔7〕。研究發(fā)現(xiàn)lncRNA和miRNA在DN中異常表達(dá)，參與了DN的發(fā)生及發(fā)展〔8〕。lncRNA XIST是一種表觀遺傳調(diào)節(jié)因子，已發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中表達(dá)失調(diào)，XIST沉默通過調(diào)節(jié)miR-320/NOD2對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用〔9〕。lncRNA XIST在脊髓損傷小鼠脊髓組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，抑制XIST表達(dá)可通過PI3K/AKT信號通路的再激活來抑制細(xì)胞凋亡而保護(hù)脊髓損傷〔10〕。XIST在心肌梗死后的心肌細(xì)胞中過表達(dá)，通過靶向miR-130a-3p調(diào)節(jié)心肌梗死〔11〕。lncRNA XIST可通過miR-211/CXCR4軸促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔12〕。敲除LncRNA-XIST通過Notch-1途徑抑制非小細(xì)胞肺癌中的增殖和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1誘導(dǎo)的EMT〔13〕。本研究結(jié)果表明lncRNA XIST在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中表達(dá)升高，下調(diào)XIST表達(dá)可抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷。且lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-30b-5p的表達(dá)。

研究發(fā)現(xiàn)miR-30c-5p通過靶向SOCS3穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)可改善缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷〔14〕。miR-30b-5p在腎細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系均低表達(dá)，過表達(dá)可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖、侵襲、遷移和EMT〔15〕。缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織中miR-30b表達(dá)下調(diào)，miR-30b可減輕小鼠肝臟缺血再灌注損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞的損傷修復(fù)〔16〕。過氧化氫處理心肌細(xì)胞可下調(diào)miR-30b的表達(dá)，miR-30b通過抑制親環(huán)素(Cyp)D可保護(hù)心臟免受缺血/再灌注損傷和減少心肌梗死范圍〔17〕。本研究結(jié)果表明在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中miR-30b-5p表達(dá)水平降低，miR-30b-5p過表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡。

TNF-α主要由巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生，可直接損害腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞，還能誘發(fā)其他炎癥因子的釋放，促進(jìn)DN的炎癥過程〔18〕。研究發(fā)現(xiàn)高葡萄糖激活的巨噬細(xì)胞釋放的TNF-α可促進(jìn)足細(xì)胞凋亡，而阻斷TNF-α的分泌可減弱足細(xì)胞凋亡和延緩DN進(jìn)展〔19〕。IL-6是免疫反應(yīng)和葡萄糖代謝的關(guān)鍵介質(zhì)，IL-6受體通過抑制炎性和減少胰島素抵抗，起到延緩糖尿病腎損傷的作用〔20〕。在慢性壓迫性損傷的大鼠模型中l(wèi)ncRNA XIST高表達(dá)，XIST下調(diào)可通過降低炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6來抑制神經(jīng)炎癥〔21〕。

綜上，lncRNA XIST可抑制高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，改善高糖誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與miR-30b-5p的表達(dá)及炎癥因子的含量有關(guān)。