賈永恒 姜濤

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科，吉林 長春 130033)

大腸癌是我國臨床常見的消化道腫瘤之一，是世界第三大惡性腫瘤〔1,2〕。大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌。近年來，盡管隨著醫(yī)療技術(shù)的改革與創(chuàng)新，大腸癌患者的生存時(shí)間有所延長，但術(shù)后5年生存率仍然較低，僅約50%〔3〕。目前，大腸癌的主要病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚，多種分子在大腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。伴隨著基因組計(jì)劃的完成，基因轉(zhuǎn)錄、蛋白修飾等生物學(xué)過程在分子水平層面的研究受到越來越多學(xué)者的重視。腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，常常伴隨著腫瘤細(xì)胞不斷生長，其惡性程度逐漸增高，氧的需求大于自身血管供應(yīng)后，引起腫瘤局部缺氧的微環(huán)境狀態(tài)。而腫瘤細(xì)胞可以通過自我調(diào)整適應(yīng)這種缺氧狀態(tài)，通過某些分子作用，促進(jìn)腫瘤發(fā)展〔4〕。缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)對細(xì)胞缺氧產(chǎn)生適應(yīng)〔5〕。惡性腫瘤細(xì)胞相比較于正常細(xì)胞，代謝率較高。腫瘤能量來源中大部分為葡萄糖，因此葡萄糖的膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程十分重要，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glut)-1在細(xì)胞膜上進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，在腫瘤的發(fā)展中起到關(guān)鍵作用〔6〕。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HIF-1α和Glut-1在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)展〔7,8〕。而對于HIF-1α和Glut-1在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義仍然具有較多爭議，機(jī)制尚未明確。因此，本文主要探討HIF-1α和Glut-1在大腸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料 隨機(jī)選取2014年1月至2016年1月于吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院胃腸結(jié)直腸肛門外科大腸癌患者32例，全部患者均行根治性大腸癌手術(shù)，術(shù)前未給予任何抗腫瘤治療，術(shù)后1 h內(nèi)獲取病理標(biāo)本及癌旁組織，存于液氮后制作成石蠟標(biāo)本保存。本研究經(jīng)過吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者及家屬簽署知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前行腸鏡檢查獲取病理標(biāo)本，明確診斷為原發(fā)性大腸癌；術(shù)前未給予放療、化療等抗腫瘤治療；未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的大腸癌患者；患者病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有嚴(yán)重高血壓、嚴(yán)重心臟疾病等其他嚴(yán)重器質(zhì)性疾病的患者；腫瘤復(fù)發(fā)再次切除者。

1.3免疫組化 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片。用80℃烤箱對切片進(jìn)行烘烤30 min，乙醇進(jìn)行脫水，并使內(nèi)源性過氧化物酶滅活，應(yīng)用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復(fù)過程；PBS洗3次，加入一抗50 μl，溫度控制于4℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μl。室溫下二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，蘇木素輕度復(fù)染，樹膠行封片處理，光鏡下觀察。

1.4結(jié)果判定 兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察切片，有爭議的免疫組化結(jié)果由第三名病理醫(yī)師進(jìn)行評估。光鏡下，以癌旁組織作為對照，HIF-1α陽性取決于細(xì)胞質(zhì)中著色的棕黃色顆粒；Glut-1陽性定義為細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中著色的棕黃色顆粒。每個(gè)切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野(每個(gè)視野計(jì)100個(gè)腫瘤細(xì)胞)，計(jì)算陽性表達(dá)率，陽性表達(dá)率<25%為陰性，≥25%為陽性。

1.5統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料服從正態(tài)分布的采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)校正，采用Logistic回歸進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1HIF-1α、Glut-1在大腸癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系 通過免疫組化發(fā)現(xiàn)HIF-1α在大腸癌中陽性表達(dá)率為42.7%；Glut-1在大腸癌中陽性表達(dá)率為53.1%。HIF-1α的表達(dá)與脈管侵犯關(guān)系密切，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.027)；與性別、年齡、分化程度，浸潤深度、神經(jīng)侵犯及淋巴轉(zhuǎn)移這些病理特征無關(guān)。同樣發(fā)現(xiàn)，Glut-1的表達(dá)與脈管侵犯有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.028)；與其他臨床病理特征間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。HIF-1α及Glut-1的表達(dá)與腫瘤的脈管侵犯密切相關(guān)。見表1，圖1。

圖1 大腸癌組織中HIF-1α、Glut-1表達(dá)(DAB，×100)

表1 HIF-1α與Glut-1的陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.2HIF-1α、Glut-1在大腸癌中表達(dá)的相關(guān)性 32例大腸癌患者中，Glut-1表達(dá)陽性共17例，其中14例HIF-1α表達(dá)陽性，HIF-1α及Glut-1在大腸癌中的表達(dá)關(guān)系密切，呈強(qiáng)正相關(guān)性(r=0.828，P<0.001)。

3 討 論

HIF是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，具有α和β兩部分。HIF-α為活性亞基，HIF-β為結(jié)構(gòu)性亞基。前者通過HIF-1α來體現(xiàn)，后者在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定〔9〕。在正常氧量條件下，在脯氨酰羥化酶(PHD)的作用下，HIF-1α被羥化，通過線粒體內(nèi)的泛素蛋白酶結(jié)合泛素化進(jìn)行降解。

HIF-1α作為缺氧適應(yīng)性反應(yīng)的主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，缺氧狀態(tài)是其最強(qiáng)調(diào)節(jié)因素。缺氧情況下，羥化酶受到抑制，進(jìn)而引起HIF-1α積累，并且通過與HIF-1β結(jié)合形成異源二聚體復(fù)合物〔10〕。復(fù)合物與目的基因啟動(dòng)子缺氧反應(yīng)元件(HRE)的核心DNA序列結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄輔助因子，同時(shí)與NCOA互相作用，導(dǎo)致活性增加。通過與氧化還原調(diào)控蛋白作用后，激活CTAD、NCOA、CREBBP等物質(zhì)，進(jìn)一步激活血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、糖酵解酶等40余個(gè)基因，參與多種生物學(xué)過程。在實(shí)體腫瘤中，由于腫瘤細(xì)胞生長速度較快，超過血管生成速度，因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，乏氧狀態(tài)為其常見狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)缺氧情況，多種細(xì)胞因子表達(dá)增高，其中最重要的就是HIF-1α。目前已經(jīng)證明HIF-1α在包括肺癌〔11〕、胃癌〔12〕、乳腺癌〔13〕等多種類型的腫瘤中過度表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在大腸癌中陽性表達(dá)率為42.7%。HIF-1α的表達(dá)與脈管侵犯關(guān)系密切，與不同性別、年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度、浸潤深度、神經(jīng)侵犯及淋巴轉(zhuǎn)移這些病理特征無關(guān)。

葡萄糖為細(xì)胞進(jìn)行代謝并產(chǎn)生能量的主要物質(zhì)來源，參與多種細(xì)胞活動(dòng)以及功能的調(diào)節(jié)。正常有氧條件下，葡萄糖通過轉(zhuǎn)化為丙酮酸后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，經(jīng)過氧化磷酸化提供能量。但在缺氧條件下，主要提供能量的途徑更改為糖酵解途徑，僅少量丙酮酸經(jīng)三羧酸循環(huán)供能。在整個(gè)供能過程中，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程作用關(guān)鍵，Glut家族在此過程中起著關(guān)鍵作用。Glut-1為葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，參與多種生物學(xué)過程。Glut-1是第一個(gè)被描述的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子，是組織細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的重要載體。Glut-1對葡萄糖具有強(qiáng)親和力，確保細(xì)胞在低濃度葡萄糖的狀態(tài)下，依然能夠轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖〔14〕。Glut-1在胚胎早期和哺乳期表達(dá)水平較高。哺乳后及成年以后，腦組織外，Glut-1表達(dá)明顯下降。但在惡性程度較高的腫瘤組織中，葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)改變?yōu)橐环N被動(dòng)過程，Glut-1的表達(dá)明顯增高，目的是將更多的葡萄糖跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而確保葡萄糖的攝取，促進(jìn)葡萄糖的利用〔15〕。研究顯示，在肝癌〔16〕、胰腺癌〔17〕等有糖酵解機(jī)制的腫瘤中均表現(xiàn)出Glut-1過表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，Glut-1在大腸癌中陽性表達(dá)率為53.1%；Glut-1表達(dá)與脈管侵犯有關(guān)，與其他臨床病理特征無關(guān)(如性別、年齡、分化程度，浸潤深度、神經(jīng)侵犯及淋巴轉(zhuǎn)移)。

Wincewicz等〔18〕研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α與Glut-1在結(jié)腸癌腫瘤組織中表達(dá)增高，這一結(jié)論與我們的研究結(jié)論相一致，不同的是Wincewicz等〔18〕并未發(fā)現(xiàn)HIF-1α與Glut-1兩者的表達(dá)與脈管侵犯相關(guān)。武雪亮等〔19〕通過對50例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Glut-1、HIF-1α 的表達(dá)陽性率均與結(jié)直腸癌漿膜浸潤、分化程度、TNM 分期、淋巴轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移及脈管浸潤有關(guān)。在我們的研究中，并未發(fā)現(xiàn)HIF-1α與Glut-1的表達(dá)與不同性別、年齡、腫瘤細(xì)胞分化程度，浸潤深度、神經(jīng)侵犯及淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Chen等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α 在大腸癌腫瘤組織中顯著降低，而且與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)受累和轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，認(rèn)為HIF-1α在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著抑癌作用。這一結(jié)果與我們的研究結(jié)果相矛盾。分析與以上結(jié)果不同的原因可能為樣本量及樣本質(zhì)量的差異，同時(shí)納入標(biāo)準(zhǔn)間仍存在不同，需要通過擴(kuò)大樣本量，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞動(dòng)物等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

脈管侵犯是消化道腫瘤常見的臨床病理特征，主要是腫瘤細(xì)胞突破黏膜上皮侵入淋巴管和血管。侵入脈管的腫瘤細(xì)胞部分抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊，與白細(xì)胞、血小板等形成聚合物，產(chǎn)生癌栓，加重腫瘤細(xì)胞缺氧狀態(tài)〔21〕。同時(shí)，新生淋巴管和血管產(chǎn)生，來適應(yīng)腫瘤細(xì)胞的缺氧狀態(tài)及能量代謝。我們的研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α與Glut-1的高表達(dá)均與大腸癌細(xì)胞的脈管侵犯密切相關(guān)。進(jìn)一步通過數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α與Glut-1在大腸癌中的表達(dá)關(guān)系密切，呈強(qiáng)正相關(guān)?？赡艿臋C(jī)制為腫瘤情況下，大腸癌細(xì)胞處于缺氧及能量代謝異常情況，為適應(yīng)缺氧HIF-1α 大量表達(dá)，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如VEGF，進(jìn)而促進(jìn)新生血管的生成，改善缺氧狀態(tài)。無氧糖酵解因素，Glut-1也出現(xiàn)大量表達(dá)，提高葡萄糖的利用，增加能量代謝。同時(shí)HIF-1α與Glut-1兩者具有協(xié)同作用，共同應(yīng)對缺氧等異常情況的發(fā)生。

綜上所述，HIF-1α和Glut-1在大腸癌組織中的表達(dá)增高與腫瘤脈管侵犯有關(guān)，通過對兩者的研究，可以為大腸癌的診斷及治療提供指導(dǎo)依據(jù)。