崔大鵬 張迎春 劉振顯 連晶晶 劉博

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1肝膽外科，河北 張家口 075000；2普通外科；3檢驗科；4病理科)

膽囊癌是消化系統(tǒng)中起病較為隱匿的一類惡性腫瘤，早期多無典型的臨床表現(xiàn)，很難做到早期診斷、早期治療，導(dǎo)致患者5年生存率低，預(yù)后比較差〔1〕。由于膽囊癌患者臨床表現(xiàn)特異性差，大部分僅表現(xiàn)為右上腹痛，甚至無明顯臨床表現(xiàn)，這對膽囊癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療提出了極大的挑戰(zhàn)。特別是對于老年患者，及目前，影像學(xué)檢查〔CT或磁共振成像(MRI)〕是最直接而有效的方法，但價格昂貴〔2〕。相較而言，腫瘤標志物敏感性和特異性俱尚可，且費用較低，具有一定推廣優(yōu)勢〔3～5〕。但是單一腫瘤標志物在腫瘤較小時就能檢測到比較困難，因此，聯(lián)合檢測在一定程度上可彌補單一檢測的不足，提高檢出率。多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測可提高對早期膽囊癌診斷的敏感性和特異性。然而至今尚未發(fā)現(xiàn)對早期膽囊癌敏感性和特異性俱佳的腫瘤標志物或腫瘤標志物組合。目前，癌抗原(CA)125的檢測已在國際上廣泛用于檢測。盡管具有很高的敏感性，但CA125在某些良性腫瘤患者，腹膜炎疾病患者和消化道腫瘤患者中也有顯著增加〔6〕。因此，其低特異性限制了其在診斷上的準確性。microRNA(miRNA)已被證明可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達〔7,8〕，并對癌癥的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。同時，源自原發(fā)腫瘤組織的循環(huán)miRNA可以高度穩(wěn)定的形式在血清/血漿中被檢測到，突顯了其在人類癌癥診斷和預(yù)后中的潛在作用〔9〕。本研究探究了血清腫瘤標志物CA125和miR-196表達與膽囊癌診斷和分期的相關(guān)性，并分析了患者的預(yù)后相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1病例資料 2017年1月至2019年1月年在河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院住院治療的老年(>60歲)膽囊癌患者共93例，年齡60～87歲，平均(69.2±5.1)歲，其中男46例，女47例。另外選取90例老年良性膽囊疾病患者和102例健康志愿者。良性膽囊性疾病患者中，膽囊炎患者52例，膽囊息肉患者26例，膽囊結(jié)石患者12例；男41例，女49例；年齡60～71歲，平均(66.4±4.6)歲。健康志愿者男52例，女50例；年齡45～71歲，平均(52.3±4.4)歲。膽囊癌的分期是根據(jù)膽囊癌規(guī)范化診治專家共識(2016版)〔10〕中關(guān)于膽囊癌的分型和分期標準和AJCC膽囊癌TNM分期(第七版)/膽囊癌TNM分期分類系統(tǒng)進行。其中Ⅱ期12例，ⅢA期15例，ⅢB期39例，ⅣA期6例，ⅣB期21例。本次研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準進行，患者簽署知情同意書。膽囊癌患者納入標準：年齡>60歲，近期被確診為膽囊癌并經(jīng)過病理證實，之前未接受過手術(shù)、化療和其他治療方法治療。排除標準：患者無法完成治療，患者之前接受過任何手術(shù)、化療或者其他治療方法治療，患者患有其他嚴重伴性疾病，如心臟病、腦血管疾病或者精神神經(jīng)類疾病。良性膽囊疾病患者和健康志愿者選擇年齡和性別與膽囊癌患者相似的病例資料，并對其進行篩查以確保其在所有實驗室檢查結(jié)果的正常范圍內(nèi)，并且沒有癌癥史。

1.2研究方法

1.2.1血清 CA125檢測 通過靜脈穿刺從GBC患者、良性膽囊疾病患者和健康志愿者中采集全血樣品。在采血后1 h內(nèi)，以10 000 r/min離心10 min分離血清，以完全去除細胞碎片。然后將血清樣品轉(zhuǎn)移至無RNase/DNase的試管中，-80℃保存。 通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中的CA125水平。

1.2.2miR-196檢測 待測血清樣品用一步PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒(Takara Bio,Shiga,Japan)合成血清中miRNAs的cDNA。反應(yīng)混合物(20 μl)包含10 μl的29 miRNA反應(yīng)緩沖液混合物，2 μl的miRNA Primescript RT酶混合物，2 μl的0.1%牛血清白蛋白(BSA)和3 μl的血清及3 μl的血清緩沖液(2.5%Tween 20,50 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA)，在37℃下孵育60 min，在85℃下孵育5 s，然后在4℃下孵育60 min。在4℃下以10 000 r/min離心10 min后，將cDNA在-20℃下保存直至使用。 使用ABI PRISM 7500序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City,CA,USA)上的SYBR PrimeScript miRNA qPCR試劑盒(Takara Bio)，以25 μl的最終體積進行miRNA的qRT-PCR。反應(yīng)試劑包含12.5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.5 μl染料Ⅱ，2 μl 正向引物(5 μmol/L,Ribo-bio，中國廣州)，1 μl 10 μmol/L的Uni-miR qPCR引物和2.0 μl模板cDNA。用無RNA的水調(diào)節(jié)體積。進行一式三份的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以去除任何殘留物。將miR-191-5p和U6的組合用作參考基因。而且，miRNA表達被記錄為相對于兩個參考基因平均值的比率。

1.2.3隨訪及資料收集 回顧性分析患者的臨床病理數(shù)據(jù)，包括性別、年齡、組織學(xué)分化、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分期和術(shù)前腫瘤標志物(血清CA196和miR-199)。 隨訪時間為從治療日期到死亡或最后一次隨訪，2019年8月完成隨訪?？偵嫫?OS)定義為從診斷到死亡的時間，無病生存期(DFS)定義為從診斷到首次局部或遠距離復(fù)發(fā)之間的時間。如果患者的病歷不完整或隨訪不足，則不能進行臨床病理特征和預(yù)后分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行Kolmogorov-Smirnov檢驗、U檢驗或t檢驗、χ2檢驗或Fisher精確檢驗、方差分析。使用Kaplan-Meier方法估算生存率，并使用對數(shù)秩檢驗比較亞組之間的生存差異，繪制受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.13組血清CA125水平比較 膽囊癌組CA125水平〔(51.59±24.76)U/ml〕明顯高于良性膽囊疾病組〔(15.65±6.37)U/ml〕、健康志愿者組〔(11.75±4.56)U/ml，F(xiàn)=125.582，P<0.001〕。同時，在不同病例分期膽囊癌患者中，Ⅱ期膽囊癌患者CA125水平(28.24±3.66)U/ml明顯低于ⅢA期(43.12±4.36)U/ml、ⅢB期(53.41±7.41)U/ml、ⅣA期(62.33±8.03)U/ml、ⅣB期(64.53±9.46)U/ml，ⅢA～ⅣB期(均P<0.05)。且CA125水平隨著腫瘤分期增加而增高。

2.2不同組別對象及不同分期膽囊癌患者血清miR-196表達的差異 膽囊癌組血清miR-196表達(5.07±2.51)顯著高于良性膽囊疾病組、健康志愿者組(1.98±1.72、1.90±1.63，F(xiàn)=77.627，P<0.001)。在不同腫瘤分期膽囊癌患者中，Ⅱ期患者miR-196表達水平(3.25±0.34)明顯低于ⅢA期(6.03±0.83)、ⅢB期(5.01±0.61)、ⅣA期(5.83±0.68)、ⅣB期(5.32±0.46,均P<0.05)。

2.3CA125、miR-196水平與膽囊癌診斷的價值 通過比較膽囊癌與非膽囊癌患者CA125和miR-196水平，繪制相關(guān)ROC曲線，CA125的ROC曲線下面積為0.919(95%CI：0.889～0.949)，截斷值為30 U/ml，敏感度為87.1%，特異性為83.9%；miR-196評分的ROC曲線下面積為0.875(95%CI：0.835～0.915)，截斷值為2.537，敏感度為87.1%，特異性為76.6%。見圖1。

圖1 ROC分析血清CA125水平與miR-196對膽囊癌的診斷價值

2.4CA125、miR-196水平與膽囊癌預(yù)后的關(guān)系 使用血清CA125水平的最佳臨界值將93例膽囊癌患者分為兩組：CAP125高水平組(CA125>30 U/ml,n=71)和CAP125低水平組(CA125≤30 U/ml,n=22)。對93例膽囊癌患者的Kaplan-Meier生存分析表明，CA125>30 U/ml組無病生存率明顯低于CA125≤30 U/ml組(38.4% vs 67.6%，P=0.009)，見圖2。使用血清miR-196水平的曲線下面積(AUC)的最佳臨界值將93例膽囊癌患者分為兩組：miR-196高表達組(miR-196>2.537,n=64)和miR-196低表達組(miR-196≤2.537,n=27)。對93例膽囊癌患者的Kaplan-Meier生存分析表明，miR-196>2.537組無病生存率明顯低于miR-196≤2.537組(31.4% vs 69.4%，P<0.001)，見圖3。

圖2 CAP125≤30 U/ml、>30 U/ml水平患者生存率

圖3 miR-196≤2.537、>2.537表達患者生存率

3 討 論

膽囊癌在消化道腫瘤中居第位，近年來，膽囊癌的發(fā)病率有逐漸增高的趨勢，但早期診斷率僅為16.68%〔11〕。目前腫瘤標志物的檢測無疑在早期發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模篩查具有更多的優(yōu)勢。腫瘤標志物的檢測對于腫瘤的早期診斷、療效評價、復(fù)發(fā)及預(yù)后評估等方面均具有非常重要的意義。

已證實源自腫瘤細胞的miRNA穩(wěn)定且易于在癌癥患者的外周血中檢測到，這可能反映了腫瘤組織中的表達模式〔12〕。血漿和血清均適合作為miRNA循環(huán)生物標志物研究〔13〕。缺氧是包括GBS在內(nèi)的許多實體腫瘤的共同特征，并且與許多基因的調(diào)節(jié)有關(guān)。 miR-196是一種內(nèi)源性的微小RNA，包括miR-196a-1、miR-196a-2、miR-196b 3個編碼基因。早期的研究發(fā)現(xiàn)，miR-196主要在食管癌中高表達〔14〕，并作為癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔15〕。但是在膽管癌中，尚未見到相關(guān)診斷和預(yù)后的研究。本研究結(jié)果說明，在老年膽管癌患者和其他患者中，miR-196表達顯著增高。同時，腫瘤分期也有miR-196表達有一定的相關(guān)性。miR-196可以作為一種膽管癌的早期篩查工具，對于膽管癌的早期發(fā)現(xiàn)具有重要的價值。miR-196的表達水平高低與患者的預(yù)后具有密切關(guān)系。目前，CA125的檢測已在國際上廣泛用于檢測各類腫瘤，在80%的卵巢癌患者中高表達，具有一定的敏感性。但是CA125在某些良性腫瘤患者，腹膜炎疾病患者也有顯著增加。也有研究發(fā)現(xiàn)CA125在膽囊癌中水平升高〔16〕，但是沒有研究CA125水平在診斷膽囊癌中的敏感性和特異性，同時缺乏與預(yù)后的相關(guān)性。本研究結(jié)果說明CA125對于老年膽管癌具有很高的診斷敏感度和特異性。CA125作為老年膽囊癌的診斷標志物，與患者的預(yù)后具有密切關(guān)系。

綜上，CA125和miR-196都可以作為老年膽囊癌早期診斷和篩查的生物標志物，并且可以作為治療效果評價、預(yù)后分析的重要工具。