蔡 行 ，石 建 ，喻恒軍 ，馮 靜 ，陳 娟 ，謝 惠 ，喻正軍 *

（1.湖南國測生物科技有限公司，湖南 長沙 410000；2.湖南中凈生物科技有限公司，湖南 長沙 410000）

非洲豬瘟病毒（African Swine fever virus，ASFV）是一類古老的病毒，早在1921年在非洲肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)，至今有約100年的歷史。非洲豬瘟（African swine fever，ASF）即是由非洲豬瘟病毒引起的家豬、野豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病，所有品種和年齡的豬均可感染，發(fā)病率和死亡率高，可達(dá)100%[1]。世界動物衛(wèi)生組織將其列為法定報告動物疫病，中國也將其列為一類動物疫病。ASF 最早于1921年在非洲肯尼亞被發(fā)現(xiàn)，1957年傳入歐洲，1971年傳入加勒比海地區(qū)和南美洲，2007年傳入高加索地區(qū)，現(xiàn)仍在非洲、南撒丁島和高加索地區(qū)流行，給世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。2018年8月3日，中國確診首例非洲豬瘟疫情，之后不斷蔓延，2020年4月19日，海南報道非洲豬瘟疫情后，我國內(nèi)地31個省份，已全部發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情。

目前尚無有效的疫苗對非洲豬瘟進(jìn)行防控，各地養(yǎng)殖場需依賴生物安全措施，并組建快速診斷實驗室，使用高精準(zhǔn)的檢測方法，對進(jìn)出入豬場物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測。該研究旨在通過比對不同廠家的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒的主要性能，為豬場實驗室提供科學(xué)的試劑盒選擇方案，幫助豬場合理選擇試劑盒，構(gòu)筑穩(wěn)固的生物安全檢測防線，阻擊非洲豬瘟的入侵。

1 材料與方法

1.1 試劑盒與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

4種商品化的非洲豬瘟病毒實時熒光PCR檢測試劑盒，A廠家試劑盒（非預(yù)混型）批次342020005，B廠家試劑盒（非預(yù)混型）批次202006，C廠家試劑盒（預(yù)混型）批次20191118，D廠家試劑盒（預(yù)混型）批次20200301；B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品GBW（E）091034（批號：2020001）購自中國牧工商集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗儀器

實時熒光定量PCR儀SLAN-48P購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 線性擴(kuò)增試驗

將B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至1 000 copies/μL、100 copies/μL、20 copies/μL、4 copies/μL、0.8 copies/μL，共5個稀釋度，使用4種試劑盒，按照其說明書配置PCR體系，進(jìn)行熒光 PCR 檢測，每個稀釋度重復(fù)3 次，同時設(shè)置陰陽性對照。分析各試劑盒對不同梯度核酸檢測Ct值，比較不同試劑盒對各稀釋度的檢出率和變異系數(shù)。

1.3.2 敏感性試驗

將B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至20 copies/μL，使用4種試劑盒對稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行熒光 PCR 擴(kuò)增，每種試劑盒重復(fù)檢測48個孔，統(tǒng)計該拷貝數(shù)下不同試劑盒的檢出率。

1.3.3 假陽性檢測試驗

使用純化水做無模板陰性對照，每種試劑盒配置46個陰性反應(yīng)，設(shè)置陰陽性對照。統(tǒng)計不同試劑盒出現(xiàn)假陽性的次數(shù)，假陽性概率最低者為佳。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性擴(kuò)增結(jié)果

使用純水做無模板陰性，每種試劑盒配置46個陰性反應(yīng)，設(shè)置陰陽性對照，統(tǒng)計不同試劑盒出現(xiàn)假陽性（有Ct值且曲線不典型）的次數(shù)，A試劑盒未檢到陽性，B試劑盒未檢測到陽性，C試劑盒檢測2個非特異性陽性反應(yīng)，D試劑盒檢測到1個非特異性陽性反應(yīng)，具體結(jié)果見圖2與表4。

使用4種試劑盒對稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測時，4種試劑盒在1 000 copies/μL、100 copies/μL兩種拷貝數(shù)的檢出率均為100%，在拷貝數(shù)稀釋至20 copies/μL時出現(xiàn)檢出率的差異：A試劑盒的檢出率為100%（3/3），B試 劑：檢 出 率為33.33%（1/3），C試劑盒的檢出率為33.33%（1/3），D試劑盒的檢出率為66.67%（2/3）。A試劑盒在20 copies/μL的檢出率高于其他試劑盒，具體結(jié)果見表1與表2。

表1 4種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒對梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品檢測Ct值

表2 4種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒對標(biāo)準(zhǔn)品檢測Ct值的變異系數(shù)

2.2 敏感性試驗結(jié)果

使用4種試劑盒對稀釋至20 copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示A試劑盒的檢出率最高為91.67%（44/48），B試劑盒的檢出率次之為85.42%（41/48），C試劑盒的檢出率為79.17%（38/48），D試劑盒的檢出率為58.33%（28/48），具體結(jié)果見圖1與表3。

圖1 4種試劑盒敏感性試驗

表3 4種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒對20 copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果

2.3 假陽性檢測試驗結(jié)果

3 討論

該研究比較了4個廠家生產(chǎn)的非洲豬瘟核酸診斷試劑盒對B646L基因標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果，結(jié)果顯示：線性擴(kuò)增試驗中，A試劑盒對20 copies/μL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品檢出率為100%（3/3），其他試劑盒對該濃度下的標(biāo)準(zhǔn)品的檢出率均未達(dá)到100%；敏感性試驗中，A試劑盒對稀釋至 20 copies/μL的48個重復(fù)，檢出率為91.67%（44/48）,其他試劑盒的檢出率分別為85.42%（41/48）、79.17%（38/48）、58.33%（28/48）；假陽性試驗中，A試劑盒和B試劑盒，未出現(xiàn)陽性反應(yīng)，C、D試劑盒分別出現(xiàn)2、1個非特異陽性反應(yīng)。綜合3個試驗的結(jié)果，A試劑盒在不同稀釋濃度下的檢出率、低濃度（20 copies/μL）的檢出率、假陽性出現(xiàn)頻次上領(lǐng)先其他試劑盒，更符合豬場實驗室對于高敏感性和低假陽性的需求，可以應(yīng)用于豬場實驗室非洲豬瘟病毒的核酸診斷。

圖2 4種試劑盒假陽性檢測結(jié)果

表4 4種非洲豬瘟核酸檢測試劑盒對純水的檢測結(jié)果

非洲豬瘟病毒對腐敗、溫度、干燥及消毒劑都具有較強(qiáng)的抵抗力。在適宜的蛋白質(zhì)環(huán)境下，非洲豬瘟病毒可在較大的溫度范圍和pH范圍內(nèi)存活，在血液、尿、糞中非常穩(wěn)定，能長時間存活于經(jīng)加工過的豬肉制品中［3］。由于ASFV在環(huán)境中穩(wěn)定、存活時間長，生物安全是防控該病毒的唯一方案，進(jìn)入豬場的物質(zhì)和人員必須進(jìn)行執(zhí)行嚴(yán)格的生物安全洗消，并進(jìn)行核酸檢測。選擇一款敏感性高、假陽性少的試劑盒，能大大提升豬場生物安全牢固程度。

試劑盒的敏感性較低，可能與引物和探針序列、試劑盒生產(chǎn)工藝相關(guān)。在臨床檢測過程中，檢出率偏低除與試劑盒敏感性有關(guān)外，還可能與樣本復(fù)雜程度、樣本采集運(yùn)輸、樣本核酸提取等各種因素相關(guān)；實驗室出現(xiàn)假陽性，可能與試劑盒不穩(wěn)定、實驗室污染、設(shè)備的閾值線設(shè)定等方面相關(guān)，豬場實驗室需要綜合各方面的因素進(jìn)行判斷，該研究中C、D試劑盒為預(yù)混裝，產(chǎn)生的假陽性可能與試劑預(yù)混后，發(fā)生非特異性反應(yīng)有關(guān)。

該研究僅對4個廠家試劑某一批號的檢測能力做了簡要比較分析，樣本量有限，并不能代表各試劑的整體檢測性能，僅作為一種試劑盒比對方案，供豬場實驗室參考，實驗室檢測能力除與試劑盒相關(guān)性能相關(guān)外，還需要實驗室的操作人員嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程，執(zhí)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，避免因操作原因引起的假陰性和假陽性結(jié)果。