周心濤，趙黎丙，閔新文，陳 嬌，郎明健

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院，湖北十堰 442000)

來源于正常足月分娩胎盤的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(human placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)具有來源廣、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，還具有自我更新和無限增殖的能力，能向多譜系分化[1－2]。本實(shí)驗(yàn)通過利用正常足月分娩的臍帶血清(umbilical cord blood serum，UCBS)分離、培養(yǎng)PMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、擴(kuò)增所用時(shí)間、細(xì)胞周期及培養(yǎng)前后細(xì)胞的表型、分化能力的改變，探討UCBS分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增PMSCs的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

L-DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(北京天根生物技術(shù)有限公司)，L-谷氨酰胺、MTT kit(Promega)。間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化試劑盒(廣州賽業(yè)生物技術(shù)有限公司)。

1.2 UCBS 制備

無菌條件下取健康產(chǎn)婦足月臍血，4℃靜置4～16 h，20℃、1 500 g離心10 min收集上層血清，0.22 μm濾器過濾，56℃水浴 30 min滅活補(bǔ)體，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PMSCs分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增

經(jīng)孕婦本人及家屬知情同意、醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，無菌條件下取健康胎兒(血清學(xué)檢查HBV，HCV，HIV和梅毒均為陰性)小塊胎盤組織，PBS充分洗滌后剔取胎兒面脫膜并剪碎。0.1% Ⅳ型膠原酶消化15～30 min，100目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞接種于T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，分別以含10%UCBS(實(shí)驗(yàn)組)和10%FBS(對(duì)照組)的α-MEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的飽和濕度環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)生長(zhǎng)至80%融合后(1～2周)，用0.05%的胰酶消化傳代。

1.4 PMSCs相關(guān)鑒定

1.4.1 PMSCs體外誘導(dǎo)分化 將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中生長(zhǎng)至第3代的PMSCs，以低密度接種至6孔板，第2天將基礎(chǔ)培養(yǎng)液更換為誘導(dǎo)液。成骨誘導(dǎo)液為高糖 DMEM、10%UCBS、地塞米松(10～8 mol/L)、磷酸甘油(10 mmol/L)及抗壞血酸(50 g/mL)。成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液為高糖DMEM、10%UCBS、地塞米松(1nmol/L)、0.5 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxantine、5 mg/L胰島素及200 mg/L吲哚美辛。每2～3 d換液1次。誘導(dǎo)2～4周后，分別用茜素紅(成骨細(xì)胞)和油紅O(脂肪細(xì)胞)染色鑒定。

1.4.2 PMSCs表面標(biāo)志鑒定 將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中生長(zhǎng)至第5代的細(xì)胞，用0.05%胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，分為每管100 μL，分別加入鼠抗人 CD105(PE，Sigma)、CD34(PE，Sigma)、CD45(CY5，Sigma)、HLA-DR(FITC，Sigma)、CD44(FITC，Sigma)及 CD29(FITC，Sigma)單克隆抗體，避光4℃孵育30 min，4%多聚甲醛固定后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 不同血清對(duì)PMSCs增殖活性的影響

MTT法檢測(cè)不同血清對(duì)PMSCs增殖活性的影響，用0.05%胰蛋白酶分別將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中生長(zhǎng)至第4代的PMSCs消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為104個(gè)/mL，每孔100 μL接種于96孔板，每組細(xì)胞培養(yǎng)液根據(jù)不同的時(shí)間點(diǎn)，各設(shè)置5個(gè)平行孔和一個(gè)空白對(duì)照。按試劑盒操作指南分別于接種后的第1、3、5、7 天每孔 20 μL加入 MTT工作液。37℃、5%CO2孵育4 h后，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定OD值。

2 結(jié)果

2.1 PMSCs的鑒定

2.1.1 PMSCs形態(tài) 實(shí)驗(yàn)組 PMSCs在2～3 d時(shí)開始貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈梭形，形態(tài)飽滿，以后細(xì)胞數(shù)逐漸增多形成漩渦狀集落，原代細(xì)胞培養(yǎng)1～2周達(dá)80%以上融合后可傳代。對(duì)照組PMSCs在3～4 d時(shí)開始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)與實(shí)驗(yàn)組無明顯差異。兩組細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)速度均明顯加快，約4 d可傳代1次。傳代2～3次后細(xì)胞純度提高，形態(tài)較原代均一，呈平行排列或漩渦狀生長(zhǎng)，見圖1。

2.1.2 PMSCs體外誘導(dǎo)分化 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)，隨著誘導(dǎo)的進(jìn)行，PMSCs由梭形逐漸變成方形，并開始出現(xiàn)聚集。誘導(dǎo)21 d后茜素紅染色可以將胞質(zhì)被染成紅色，且實(shí)驗(yàn)組茜素紅染色陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組;成脂誘導(dǎo)后PMSCs逐漸開始出現(xiàn)油滴，誘導(dǎo)28 d后油紅O染色陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

2.1.3 PMSCs表面標(biāo)志 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，無論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組中，PMSCs都高表達(dá)CD29、CD44及CD105，不表達(dá)或低表達(dá) CD34、CD45及HLA-DR，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。

2.2 MSCs在含UCBS培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線

PMSCs在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中培養(yǎng)時(shí)均表現(xiàn)為第2～5天成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，第6～7天后進(jìn)入平臺(tái)期，生長(zhǎng)變緩，而且實(shí)驗(yàn)組的增長(zhǎng)率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，圖4。

3 討論

PMSCs是從人胎盤組織中分離的一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，除了能分化為脂肪、軟骨、成骨細(xì)胞等本胚層細(xì)胞外，在適當(dāng)?shù)臈l件性還能轉(zhuǎn)分化為骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞等胚層的細(xì)胞。PMSCs在缺血性卒中、帕金森氏癥及脊髓損傷等各種神經(jīng)功能障礙疾病模型中的治療效果已經(jīng)得到了證實(shí)[3]，但常規(guī)用于PMSCs體外培養(yǎng)的FBS中含有異源性蛋白及未知的細(xì)胞因子，這些蛋白和細(xì)胞因子可能會(huì)對(duì)人體有害，因而影響MSC的臨床應(yīng)用[4]。

圖1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)PMSCs原代細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)(40×)Fig.1 The morphology of PMSCs in experimental and control groups

圖2 PMSCs體外成骨和成脂誘導(dǎo)分化(200×)Fig.2 Osteogenesis and adipogenesis differentiation of PMSCs in vitro

圖3 PMSCs的免疫表型鑒定Fig.3 The immunophenotype identification of PMSCs

圖4 PMSCs在兩種培養(yǎng)液中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curves of PMSCs in the two groups

近年，很多人源性的替代品已經(jīng)被用來代替動(dòng)物血清進(jìn)行干細(xì)胞培養(yǎng)，并取得了理想的效果[5]。UCBS比FBS含有更高濃度的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，有利于干細(xì)胞擴(kuò)增，細(xì)胞形態(tài)更好、免疫原性更低[6－8]。利用UCBS代替FBS培養(yǎng)人骨髓來源的MSC(human bone marrow-derived MSC，BM-MSC)，在連續(xù)傳代的過程中一直保持MSC的形態(tài)和高的增殖活性[9－11]。有學(xué)者利用處理過的臍帶血漿分離的帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord-derived MSC，hUC-MSCs)能保持較高的增殖活性和分化潛能[12]，CBS培養(yǎng)的MSC即使在高代數(shù)時(shí)仍具有較高的克隆形成潛能和MSC相關(guān)特性[13]。UCBS培養(yǎng)各種MSC的報(bào)道較多，但用于分離PMSCs的報(bào)道并不多見。UCBS、PMSCs及 hUC-MSCs同為胎兒附屬物，理論上UCBS中所含細(xì)胞因子的濃度、比例等應(yīng)該更適合PMSCs及hUC-MSCs的生長(zhǎng)。本研究利用UCBS進(jìn)行PMSCs的分離培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)的結(jié)PMSCs進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示PMSCs在含UCBS的培養(yǎng)液中可穩(wěn)定生長(zhǎng)，顯微鏡下其形態(tài)呈梭形，達(dá)到一定的密度后呈漩渦狀生長(zhǎng)，復(fù)蘇及傳代貼壁率、貼壁時(shí)間都正常，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d后茜素紅染色成棕紅色，成脂誘導(dǎo)28 d后油紅O染色陽(yáng)性;流式細(xì)胞分析檢測(cè)其高表達(dá) CD29、CD44 及 CD105，低表達(dá) CD34、CD45 及HLA-DR。PMSCs在含UCBS的培養(yǎng)液中能長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)，并保持其活力和間充質(zhì)干細(xì)胞特性。而且PMSCs在UCBS培養(yǎng)液中的增殖率明顯高于含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液。表明UCBS可以替代FBS用于分離、純化、培養(yǎng)、擴(kuò)增PMSCs，因人臍帶血血漿完全是人源性的，可符合臨床對(duì)PMSCs的培養(yǎng)要求。

[1]張芬熙，洪艷，梁文妹.人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013(1):5 －9，15.

[2]Montanucci P，Basta G，Pescara T，et al.New simple and rapid method for purification of mesenchymal stem cells from the human umbilical cord Wharton jelly[J].Tissue Eng Part A，2011(17):2651－2661.

[3]姚旺祥.胎盤干細(xì)胞在組織工程中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生，2012(36):9－11.

[4]Spees JL，Gregory CA，Singh H，et al.Internalized antigens must be removed to prepare Hypoimmunogenic mesenchymal stem cells for cell and gene therapy[J].Mol Ther，2004(5):747 －756.

[5]Tekkatte C，Gunasingh GP，Cherian KM，et al."Humanized"stem cell culture techniques:the animal serum controversy[J].Stem Cells Int，2011(2011):504 －723.

[6]Ang LP，Do TP，Thein ZM，et al.Ex vivo expansion of conjunctival and limbal epithelial cells using cord blood serum-supplemented culture medium[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2011(9):6138 －6147.

[7]Nimura A，Muneta T，Koga H，et al.Increased proliferation of human synovial mesenchymal stem cells with autologous human serum[J].Arthritis Rheum.2008(2):501－510.

[8]Lin HT，Tarng YW，Chen YC，et al.Using human plasma supplemented medium to cultivate human bone marrow-derived mesenchymal stem cell and evaluation of its multiple-lineage Potential[J].Transplant Proc，2005(10):4504－4505.

[9]Shetty P，Bharucha K，TanavdeV.Human umbilical cord blood serum can replace fetal bovine serum in the culture of mesenchymal stem cells[J].Cell Biol Int，2007(3):293－298.

[10]Ma HY，Yao L，Yu YQ，et al.An effective and safe supplement for stem cells expansion ex vivo:cord blood serum[J].Cell Transplant，2012(5):857 －869.

[11]Ding Y，Yang H，F(xiàn)eng JB，et al.Human umbilical cordderived MSC culture:the replacement of animal sera with human cord blood plasma[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim，2013(10):771－777.

[12]劉玉磊，楊東生.銀屑病患者皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的表達(dá)水平及其意義[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2014(16):78－81.

[13]鄒金才.順產(chǎn)產(chǎn)婦臍帶血中抗氧化劑水平與分娩疼痛的相關(guān)性[J].貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014(2):221－224.