李晶

【摘 要】目的：分析研究三種藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性。方法：選擇生長(zhǎng)在強(qiáng)輻射且溫度波動(dòng)大、海拔高環(huán)境下的黨參、連翹、黃芪這三種青藏高原移栽藥用植物作為本次研究的對(duì)象，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)及分離培養(yǎng)方法等手段，對(duì)上述三種藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的狀態(tài)、遺傳多樣性等方面內(nèi)容加以研究。結(jié)果：連翹、黃芪及黨參這三種藥用植物中，皆存在內(nèi)生細(xì)菌且菌群類型非常豐富；其內(nèi)生細(xì)菌由HGC、β-proteobacteria、CFB、厚壁菌門組成；具有耐鹽性，且存在對(duì)抗生素的抗藥性。結(jié)論：本次研究結(jié)論有利于更清楚、全面的認(rèn)知在極端環(huán)境下，植物內(nèi)生細(xì)菌的生理特性、菌群結(jié)構(gòu)，可豐富青藏高原藥用植物內(nèi)生細(xì)菌資源。

【關(guān)鍵詞】黨參；黃芪；連翹；生細(xì)菌；多樣性

青藏高原太陽(yáng)輻射較強(qiáng)、氧氣不充足，由于受到低溫及干旱的天氣影響，動(dòng)植物在這里很難生長(zhǎng)。本次研究的黨參、黃芪、連翹三種植物均喜涼爽氣候，抗旱、抗旱能力較強(qiáng)，其地下根系發(fā)達(dá)，可有效固土、防風(fēng)。隨著人們對(duì)藥用植物需求量的逐漸擴(kuò)大，發(fā)展人工種植藥用植物也變得重要起來(lái)。雖然就藥用植物的栽培技術(shù)與育種等方面來(lái)說(shuō)有了很多研究結(jié)果，但在與微生物及藥用植物間的研究卻相當(dāng)匱乏 [1]。本次研究通過(guò)微生物、分子生物學(xué)手段，對(duì)三種藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

（1）植物選擇。試驗(yàn)所用黨參、黃芪、連翹，均未見(jiàn)有病害癥狀，無(wú)沖孔，根際土應(yīng)同時(shí)帶回。

（2）內(nèi)生菌的分離、純化。分別取黃芪、黨參及連翹三者1g植物葉片，做無(wú)菌水沖洗處理，并使用濾紙將水分完全吸凈；依次再做如下處理：持續(xù)30s～1min的70%酒精表面消毒，無(wú)菌水沖洗處理；8分鐘～10分鐘的1‰升汞浸泡，做徹底消毒處理，并無(wú)菌水沖洗；取200ul（最后一次沖洗葉片）的無(wú)菌水，涂抹在LB固體培養(yǎng)基平板上，并在28℃的外部條件下，持續(xù)培養(yǎng)3d，最后檢測(cè)表面滅菌效果。

對(duì)已經(jīng)做好了表面滅菌處理的植物葉片進(jìn)行研磨，并借助于逐級(jí)稀釋法，將其稀釋到濃度保持在105倍，在LB培養(yǎng)基上，涂布200ul不同稀釋濃度的勻漿液。濃度不同做三次重復(fù)，在外界溫度為28℃的條件下，培養(yǎng)時(shí)間持續(xù)2天；記錄每個(gè)平板上菌落的數(shù)量，同時(shí)依據(jù)菌落的大小、顏色以及形狀等形態(tài)內(nèi)容，選擇存在差異的菌落，將其放于相同的培養(yǎng)基平板之上，進(jìn)行純化培養(yǎng)；將純化培養(yǎng)之后的細(xì)菌接種與相對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的斜面上，于4℃的條件下保存。

（3）內(nèi)生細(xì)菌16SrDNA序列測(cè)定、同源性對(duì)比。做16SrDNA基因測(cè)序時(shí)，選取有典型RFLP帶型的菌株，序列長(zhǎng)度設(shè)定為1500bp，對(duì)比采用BLAST，最終確定伴有較高同源性的16SrDNA序列；應(yīng)用CLUST-ALX做序列對(duì)比。

（4）適合PH值的測(cè)定[2]。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各菌原液共100ul，將其加入到PH值分別為4.0、5.0依次直至11.0的5lLB液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下，經(jīng)過(guò)持續(xù)24h的培養(yǎng)之后，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

（5）耐鹽性。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各菌原液共100ul，將其加入到NaCL濃度分別在5%、7%、9%、11%的5ml LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1天后，對(duì)其渾濁度進(jìn)行觀察。

（6）抗藥性。取四環(huán)素、利福平、卡那霉素、鏈霉素、羧芐青霉素、慶大霉素的抗生物紙片，取200ul培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液加入到LB固體培養(yǎng)基中均勻涂布，將抗生素紙片放入其中，于28℃條件下培養(yǎng)72h，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果

（1）內(nèi)生細(xì)菌分離的結(jié)果。經(jīng)分離結(jié)果表明，培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出了大量形態(tài)各異的菌落。這也說(shuō)明，黃芪、黨參、連翹這三種藥用植物的葉片組織不僅存在大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，而且其內(nèi)生細(xì)菌的類群十分豐富。分離共獲得42株內(nèi)生細(xì)菌。依據(jù)其不盡相同的形態(tài)加以歸類。在分離出的內(nèi)生細(xì)菌中，存在有83.3%的菌株可產(chǎn)橘紅、肉紅以及黃色色素。

（2）內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性。三種藥用植物分離出的內(nèi)生細(xì)菌具有較近的親緣關(guān)系；內(nèi)生細(xì)菌可分為四大類群，即包括HGC（高G+C含量的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌）、β-proteobacteria、CFB（黃桿菌/嗜纖維菌/擬桿菌群）、厚壁菌門（Firmicutes），種屬類型豐富。

（3）適宜PH值。三種藥用植物內(nèi)生細(xì)菌均不適宜在較強(qiáng)酸性的環(huán)境下生長(zhǎng)，在PH值為7.0～9.0的中性偏堿性環(huán)境下可獲得較好長(zhǎng)勢(shì)。

（4）耐鹽性。本次研究中各菌株在NaCL濃度為0%～8%的培養(yǎng)基中均可成長(zhǎng)，說(shuō)明菌株耐鹽性極強(qiáng)，均為耐鹽菌。

（5）抗藥性。黨參、黃芪、連翹三種內(nèi)生物細(xì)菌皆存在對(duì)抗生素的抗藥性，可豐富其生物學(xué)作用。

3 討論

本次研究對(duì)黃芪、連翹及黨參這三種青藏高原藥用植物內(nèi)生細(xì)菌做了一些研究，在借助于各項(xiàng)檢測(cè)手段的基礎(chǔ)上，分析了植物內(nèi)生細(xì)菌與環(huán)境的關(guān)系，就其本質(zhì)來(lái)說(shuō)，屬于對(duì)所處環(huán)境的適應(yīng)性。這也在一定程度上給我們開(kāi)辟了新思路去認(rèn)識(shí)植物內(nèi)生細(xì)菌，還需深入進(jìn)行探索。

參考文獻(xiàn)

[1]方曉梅，張玉琴，魏玉珍等.藥用植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性及其抗HIV活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的初步篩選[C].第四屆全國(guó)微生物資源學(xué)術(shù)暨國(guó)家微生物資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)研討會(huì)論文集，2012：110-111.

[2]畢江濤，楊薇，李萍等.瀕危藥用植物沙冬青內(nèi)生細(xì)菌分離及其抑菌活性初步分析[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2013，25（12）：1621-1626+1652.