陳　淳，林清洪，林志楷，劉黎卿，陳　菲，劉鴻洲(福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361006)

番石榴葉黃酮類化合物提取及其粗提物對蔬菜病原真菌的抑菌活性

陳淳，林清洪，林志楷，劉黎卿，陳菲，劉鴻洲
(福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門361006)

采用溶劑法提取番石榴Psidium g uajava葉總黃酮，通過對溶劑濃度、提取溫度、時間、料液比等因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化番石榴葉總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，溶劑法提取番石榴葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)為：80 ℃加熱，60%乙醇，料液比1∶15，加熱回流提取1 h，在此條件下總黃酮提取率達(dá)3.51%。番石榴葉總黃酮粗提物對茄子白絹病菌、甘藍(lán)黑斑病菌、白菜炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌的室內(nèi)抑菌EC50分別為184、209、180、102 mg·mL-1。

番石榴葉；總黃酮；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；蔬菜病原菌；抑菌作用

antifungus

番石榴Psidium guajava為桃金娘科番石榴屬植物，我國廣東、廣西、四川、福建等地均有分布，其葉片全年可采摘，資源十分豐富[1]。番石榴葉中含有豐富的黃酮類化合物、酚類化合物、多糖、無機(jī)元素、揮發(fā)油、皂苷及齊墩果酸與熊果酸等多種功能成分[2]。我國民間常用番石榴葉及其提取物治療急性或慢性腸炎、痢疾等疾病。中醫(yī)認(rèn)為，番石榴葉性平，味干澀，具有生津止渴、除煩、收斂止瀉、消炎止血、止癢、驅(qū)蟲等功用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，番石榴葉具有降血糖、抗氧化、抗病毒、抗菌等藥理學(xué)作用。近年來，有關(guān)黃酮類化合物的藥理作用研究較多，發(fā)現(xiàn)其具有防心腦血管病、抗氧化、鎮(zhèn)痛、抗病毒、抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。

目前，多數(shù)關(guān)于番石榴葉的抗菌研究是針對直接影響人體健康的病原菌[1—3]，而對植物病原菌的抑制效果研究較少。利用番石榴葉的抗菌作用研制植物源抗菌農(nóng)藥，不僅能解決栽培過程中番石榴葉的浪費(fèi)問題，還可以減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，為食品安全提供新渠道。本文以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，對番石榴葉總黃酮提取工藝及其粗提物對蔬菜病原真菌的抑菌作用進(jìn)行初步探討，為開發(fā)新型的植物源殺菌農(nóng)藥提供科學(xué)依據(jù)。

l　材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器722N型分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；SHBⅢ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；ZFQ85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海醫(yī)械專機(jī)廠)；AL204電子天平(METTLERTOLEDO)；HWS-20恒溫水浴箱(江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)。

1.1.2試劑蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所)；95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、馬鈴薯、瓊脂、葡萄糖等為分析純。

1.1.3植物材料與供試病原菌物番石榴葉(品種為‘珍珠’番石榴)；甘藍(lán)黑斑病菌Alternaria brassicae、白菜炭疽病菌Colletotrichum hi ggisianum、茄子白絹病菌Pellicularia ro lfsii、黃瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum f. sp. cucrmerinum由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

1.2方法

1.2.1總黃酮含量測定參照蔡定建等[4]和謝明勇等[5]的方法，并略作調(diào)整。

1.2.1.1測定波長確定精密稱取干燥蘆丁對照品20 mg，置于100 mL容量瓶中，60%乙醇溶解，定容，得標(biāo)準(zhǔn)對照液(含蘆丁0.200 g·L-1)。精密移取蘆丁對照液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入60%乙醇稀釋至5 mL，加入50 g·L-1亞硝酸鈉溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加100 g·L-1硝酸鋁溶液0.30 mL，搖勻，靜置6 min；再加40 g·L-1氫氧化鈉溶液10 mL搖勻，靜置15 min。分光光度計(jì)以60%乙醇調(diào)零，從200 nm至600 nm進(jìn)行全波長掃描，測得505 nm處有最大吸收，因此以505 nm為測定波長。

1.2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)對照液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，按照1.2.1.1的方法進(jìn)行操作。以第一瓶溶液為空白調(diào)零，于505 nm測吸光度；以濃度(C)和吸光度(A)進(jìn)行線性回歸，得方程：A= 1.574 08 × C + 0.007 67 (r= 0.999 15)。

1.2.1.3番石榴葉樣品總黃酮含量測定精密稱取不同提取條件所得番石榴葉提取液1 mL，按照1.2.1.1的方法進(jìn)行操作。根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮濃度，并計(jì)算樣品總黃酮含量。

樣品總黃酮含量(%)= 總黃酮濃度 × 提取液體積/番石榴葉干重 × 100%

1.2.2總黃酮提取單因素試驗(yàn)采用溶劑法提取番石榴葉總黃酮，主要考慮溶劑濃度、提取時間、提取溫度、料液比等因素[6]。

1.2.2.1乙醇濃度準(zhǔn)確稱取一定量粉碎的番石榴干燥葉，分別用體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、95%乙醇按料液比1∶15(W/V)于80 ℃水浴回流提取1.5 h后過濾，測定總黃酮含量。

1.2.2.2溫度準(zhǔn)確稱取一定量粉碎的番石榴干燥葉，用60%乙醇按料液比1∶15 (W/V)分別以 50、60、70、80、90 ℃水浴溫度回流提取1.5 h后過濾，測定總黃酮含量。

1.2.2.3料液比準(zhǔn)確稱取粉碎的番石榴干燥葉一定量，用60%乙醇分別按料液比1∶5、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(W/V)以 80 ℃水浴回流提取1.5 h后過濾，測定總黃酮含量。

1.2.2.4提取時間準(zhǔn)確稱取一定量粉碎的番石榴干燥葉，用60%乙醇按料液比1∶15 (W/V)以85 ℃水浴分別回流提取1、1.5、2、2.5、3 h后過濾，最后測定總黃酮含量。

1.2.3總黃酮提取正交試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇提取溫度、溶劑濃度、料液比、回流提取時間4個因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，選用L16(44)正交表，因素水平見表1。

1.2.4室內(nèi)抑菌試驗(yàn)將優(yōu)化條件下提取的番石榴葉總黃酮粗提液在旋蒸儀上抽至近干，去除乙醇；加入無菌水，使之濃度為 1 g·mL-1干葉提取物，即該溶液番石榴葉總黃酮含量為35.1 mg·mL-1。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平Table 1　Factors and levels of orthogonal test

采用菌落生長速率法檢測總黃酮粗提物對蔬菜病原真菌的抑菌效果。在無菌條件下，將上述提取液配制成濃度分別為0、25、50、100、200、400 mg·mL-1(即總黃酮含量為0、0.88、1.76、3.51、7.02、14.04 mg·mL-1)番石榴葉總黃酮粗提液的馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)，以0 mg·mL-1的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理5個重復(fù)。將帶毒平板培養(yǎng)基及對照置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中甘藍(lán)黑斑病菌、黃瓜枯萎病菌培養(yǎng)5 d，白菜炭疽病菌、茄子白絹病菌培養(yǎng)2 d。在規(guī)定時間內(nèi)觀察記錄菌絲生長情況，十字交叉法測量菌落生長直徑，求出毒力回歸方程式及相關(guān)系數(shù)r、EC50[7—9]。

菌絲生長抑制率(%)= [1 -（處理菌落直徑-菌餅直徑)/ (對照菌落直徑-菌餅直徑)] × 100%

2　結(jié)果與分析

2.1黃酮提取的單因素及正交試驗(yàn)

2.1.1乙醇濃度選擇由圖1可知，乙醇濃度對番石榴葉總黃酮的提取有較大影響。當(dāng)乙醇濃度小于60%，隨著乙醇濃度的增大，番石榴葉總黃酮的得率隨之提高。這可能是因?yàn)橐话愕狞S酮苷元難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑[10]，乙醇濃度增大更利于黃酮苷元溶解。當(dāng)乙醇濃度超過60%，隨著乙醇濃度增大，番石榴葉總黃酮得率降低?？赡苁歉邼舛鹊囊掖既芤菏沟靡恍┐既苄噪s質(zhì)、色素、強(qiáng)親脂性成分溶出量增加，雜質(zhì)與黃酮類化合物競爭與乙醇水分子溶液體系結(jié)合，導(dǎo)致提取率下降[11]。

2.1.2溫度選擇在溶劑提取傳質(zhì)的過程中，溫度既影響溶質(zhì)在溶劑中的溶解速度，又影響溶質(zhì)向外擴(kuò)散的速度。溫度升高，傳質(zhì)速率增加，擴(kuò)散速度加快，提取速率隨之加快。但溫度過高會影響活性物質(zhì)的活性，甚至使之完全失活[12]。由圖1可知，隨著提取溫度的升高，番石榴葉總黃酮的得率不斷升高。但溫度達(dá)到 80 ℃以上，番石榴葉總黃酮得率反而降低，這可能是由于長時間高溫加熱使部分番石榴葉總黃酮發(fā)生氧化或分解。故回流提取水浴溫度定為80 ℃。

2.1.3料液比選擇一般溶劑用量越大越有利于黃酮類物質(zhì)擴(kuò)散，對黃酮類物質(zhì)的溶解能力也越強(qiáng)，提取效果越好。降低料液比，也就增加了提取時物料和溶劑中溶質(zhì)的濃度差，增加了黃酮類物質(zhì)溶解速率[11]。由圖1可以看出，降低料液比，番石榴葉總黃酮的得率也隨之增大。當(dāng)料液比大于1∶20時，料液比降低，番石榴葉總黃酮的得率增長較快；當(dāng)料液比小于1∶20時，番石榴葉總黃酮的得率增幅變化不大?？紤]到使用大量溶劑會對后續(xù)處理造成負(fù)擔(dān)，使生產(chǎn)成本和時間大大增加，因此料液比以1∶15最為合適。

圖 1　乙醇濃度、溫度、料液比和時間對番石榴葉總黃酮提取率的影響Fig. 1　Effects of solvent concentration, temperature, solid-liquid ratio and time on the extraction of flavonoids from guava leaves

2.1.4 提取時間選擇由圖1可以看出，提取時間不超過1.5 h時，番石榴葉總黃酮的得率隨著提取時間延長迅速提高；但提取2 h得率反而有所下降。這可能與番石榴葉總黃酮長時間受熱而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變有關(guān)。因此，回流提取時間以1.5 h最佳。

2.1.5正交試驗(yàn)由正交試驗(yàn)分析結(jié)果可知(表 2)，影響番石榴葉總黃酮提取的主次因素依次為提取溫度 > 乙醇濃度 > 提取時間 > 料液比；其中提取溫度對提取率的影響顯著(P<0.05)；提取的最佳方案為A4B3C1D1，即用80 ℃加熱，60%乙醇，料液比1∶15，加熱回流提取1 h。

2.1.6驗(yàn)證試驗(yàn)取番石榴葉干粉3份各10 g，按照優(yōu)選的提取工藝進(jìn)行試驗(yàn)，測得總黃酮平均提取率為3.51%，RSD為2.54%，表明正交試驗(yàn)確定的提取工藝穩(wěn)定可行。

表 2　正交試驗(yàn)方案及粗黃酮提取率Table 2　Program and results of orthogonal test

2.2總黃酮粗提物對蔬菜病原真菌的抑菌活性

番石榴葉總黃酮的粗提物對4種病原菌菌絲生長的毒力強(qiáng)弱依次為黃瓜枯萎病菌、白菜炭疽病菌、茄子白絹病菌、甘藍(lán)黑斑病菌(圖2)。其中，對黃瓜枯萎病菌的毒力最強(qiáng)，EC50為102 mg·mL-1(表3)。

圖2　番石榴葉總黃酮粗提取液對4種蔬菜病原菌菌絲生長的抑制效果(左為CK)Fig. 2　Inhibition effects of flavonoid crude extracts from guava leaves on mycelial growth of 4 kinds of vegetable pathogens

3　討論

近年來對番石榴葉的利用研究不斷深入。番石榴葉水提取物對11種細(xì)菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其抑菌譜廣、抑菌效果好，在抗菌藥物方面具有很好的開發(fā)價值[13—15]；柯昌松等[16]進(jìn)一步對番石榴葉有效成分進(jìn)行分離純化，發(fā)現(xiàn)番石榴葉中的槲皮素對常見的腐敗菌和致病菌有很好的抑菌效果。以上研究說明番石榴葉含有對病原菌有很好抑制作用的活性成分。

目前對番石榴葉的抑菌研究主要是針對直接影響人體健康的病原菌，尚未見針對植物病原菌抑菌效果的研究?，F(xiàn)今合成農(nóng)藥的泛濫使用，給環(huán)境和人類帶來嚴(yán)重威脅，尋找安全有效的植物源農(nóng)藥迫在眉睫。本研究表明，番石榴葉的總黃酮粗提液在室內(nèi)對4種蔬菜病原菌菌絲生長具有較好的抑制作用，說明它在作為植物源農(nóng)藥方面具有較好的開發(fā)價值。

表3　番石榴葉總黃酮粗提取液對4種蔬菜病原菌菌絲生長的抑制Table 3　Inhibition effects of flavonoid crude extracts from guava leaveson mycelial growth of 4 kinds of vegetable pathogens

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Extraction of Total Flavonoids from Psidium guajava Leaves and Its Inhibition on Vegetable Pathogenic Fungi

CHEN Chun, LIN Qing-hong, LIN Zhi-kai, LIU Li-qing, CHEN Fei, LIU Hong-zhou
(Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant, Fujian Institute of Subtropical Botany, Xiamen
361006, Fujian China)

Orthogonal experiments about the solvent concentration, temperature, time, solid-liquid ratio were carried out to investigate the extraction process of flavonoids from guava leaves by solvent method. The results showed that the optimal extraction processes were 60% alcohol with solid-liquid ratio as 1∶15(W/V), then heating at 80 ℃ to reflux for 1 h. The yield of total flavonoids extraction could reach up to 3.51% under the optimal condition. Furthermore, the EC50of the total flavonoids crude extracts to Alternaria brassicae, Colletotrichum higgisianum, Pellicularia rolfsii, Fusarium oxysporum f. sp. cucrmerinum were 184, 209, 180, 102 mg·mL-1.

Psidium guajava leaves; total flavonoids; orthogonal test design; vegetable pathogen;

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.04.004

Q946

A

1009-7791(2015)04-0284-05

2015-11-30

廈門市科技計(jì)劃項(xiàng)目(3502Z20132003)

陳淳，本科，助理研究員，從事植物活性成分研究。E-mail: 275586817@qq.com