陳　淳，劉黎卿，陳　菲，林志楷，李惠華，劉鴻洲（福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門361006）

番石榴葉乙醇提取物中熊果酸富集的初步研究

陳淳，劉黎卿，陳菲，林志楷，李惠華，劉鴻洲
（福建省亞熱帶植物研究所，福建省亞熱帶植物生理生化重點實驗室，福建 廈門361006）

對番石榴Psidium guajava葉乙醇提取物中熊果酸富集工藝的除雜和酸堿富集主要環(huán)節(jié)進行優(yōu)化試驗。結果表明，最佳富集工藝為：以料液比為1∶50的水和石油醚除去雜質；酸堿富集過程中富集條件以10% NaOH堿化提取液pH=14，再以5% H2SO4酸化調節(jié)pH=3，用1倍樣品溶液體積的pH=3酸性水溶液稀釋。終產品中熊果酸的純度和回收率分別為17.74%和85.12%。

番石榴葉；熊果酸；正交試驗；富集工藝

番石榴Psidium gu ajava，又名雞矢果、百子樹、芭樂、紅心果、喇叭果等，為桃金娘科番石榴屬植物，是常綠小喬木或灌木。番石榴是一種適應性很強的熱帶果樹，原產墨西哥、巴西等熱帶地區(qū)，約17世紀末傳入我國，現(xiàn)在臺灣、廣東、廣西、福建、江西等?。▍^(qū)）均有栽培，有的地方已逸為野生果樹。番石榴葉具有明顯的降血糖、抗病毒及抗菌等活性。近年來，國內外對番石榴葉的藥理作用研究逐漸深入［1］。

目前，關于番石榴葉有效成分研究大多集中于黃酮類物質，對番石榴葉熊果酸的提取富集研究較少。熊果酸是一種三萜類化合物，廣泛存在于天然植物中，被證明有望成為低毒、有效的新型天然抗癌藥物［2—3］，其藥理、病理及分子機制的研究已受到重視［4］。

關于熊果酸的提取富集有較多研究，如枇杷Eriobotrya japonica葉、白花泡桐Paulownia fortunei葉、苦丁茶Ilex latifolia、山楂Crataegus pinnatifida等［5—9］。但未見從番石榴葉中提純熊果酸的報道。從其他植物中分離熊果酸的工藝主要有三種：一是將乙醇提取液減壓濃縮后用有機溶劑萃取，如氯仿、二氯甲烷、丙酮、苯等［8］，該工藝成本高，污染嚴重；二是將提取液減壓濃縮，用硅膠柱或交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離富集［10］，該工藝柱填料成本高，工藝過程復雜，并且常用有毒有機溶劑作洗脫劑，污染環(huán)境；第三種是采用酸堿沉降法，沉淀法可以得到純度較高的熊果酸，相對于前兩種方法，環(huán)境污染較輕［11］。本研究選用酸堿沉降法，通過對番石榴葉熊果酸富集過程中堿化、酸化的pH值以及酸性水溶液沉降條件的探索，掌握提高番石榴葉熊果酸富集的關鍵參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料

番石榴葉原料（品種為‘珍珠’番石榴）；石油醚、95%乙醇、氫氧化鈉、硫酸皆為分析純，購自中國醫(yī)藥上海化學試劑公司。

1.2儀器

DELTA320 pH計［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］、低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）、DZF-6050型真空干燥箱（上海精宏實驗設備公司）、HHS-4型恒溫水浴鍋（上海橫平儀器儀表廠）、PL2002電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］、BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、SHZ型循環(huán)水真空泵（河南省鞏義市杜甫儀器廠）、BC-R202B真空旋轉蒸發(fā)儀（上海貝凱生物化工設備有限公司）、UV-2501PC分光光度計（日本島津公司）、Waters2695高效液相色譜儀。

1.3方法

1.3.1樣品制備稱取番石榴葉原料500.0 g，用95%乙醇按照料液比1∶15 （W/V）、85 ℃水浴回流提取1 h后過濾。旋轉蒸發(fā)除去溶劑，真空干燥箱40 ℃干燥后過60目篩得粉末。

移取25 mL提取液濃縮，干燥，用甲醇溶解并定容，作為測試樣品。采用高效液相色譜法測定熊果酸含量，計算提取熊果酸的得率［10—13］。

熊果酸得率（%） =提取液中熊果酸含量（g）/番石榴葉干重（g）×100%

1.3.2水溶解除雜

1.3.2.1水用量選擇稱取干燥樣品粉末5份，每份1.0 g，分別加水20、30、40、50、60 mL。超聲波溶解后，以4000 r·min-1離心20 min。去除上清液，真空干燥沉淀，稱重。

1.3.2.2離心時間選擇稱取干燥樣品粉末5份，每份1.0 g，加水60 mL超聲波溶解后，以4000 r·min-1分別離心10、15、20、25、30 min。去除上清液，真空干燥沉淀并稱重。

1.3.3石油醚溶解除雜

1.3.3.1樣品制備取10.0 g由1.3.1制得的樣品粉末，加水500 mL，超聲波溶解，以4000 r·min-1離心分離25 min后，真空干燥沉淀物，得到干燥樣品粉末。

1.3.3.2石油醚用量選擇稱取1.3.3.1制得樣品粉末5份，每份1.0 g，分別加石油醚20、40、60、80、100 mL。超聲波溶解后過濾，將所得濾渣真空干燥，稱重。

1.3.3.3石油醚溶解次數(shù)選擇準確稱取1.3.3.1制得的樣品粉末1.0 g，加石油醚50 mL，超聲波溶解后過濾，濾渣真空干燥，稱重。再用石油醚以固液比1∶50（W/V）溶解5次，分別真空干燥濾渣并稱重。每次溶解所得的石油醚溶液在λ=669 nm處測定吸光度。

1.3.4乙醇溶解次數(shù)選擇

1.3.4.1樣品制備準確稱取干燥的乙醇提取物5.0 g，加入250 mL水，超聲波溶解后離心并干燥不溶物，再以固液比1∶50（W/V）加石油醚超聲波溶解3次，過濾后真空干燥得濾渣。

1.3.4.2乙醇溶解次數(shù)選擇稱取上述濾渣干燥物1.0 g，加入95%乙醇20 mL，用超聲波溶解后離心，收取濾液，重復5次。將濾液分別減壓濃縮后真空干燥，采用HPLC法測定熊果酸含量，確定合適的溶解次數(shù)。

1.3.5酸堿沉降法富集熊果酸的單因素及正交試驗［11］

1.3.5.1堿化pH選擇準確稱取1.3.4.1濾渣干燥物10.0 g，加入95%乙醇200 mL，用超聲波溶解后離心，取上清液，重復3次。合并上清液，以10% NaOH調節(jié)溶液pH值分別為9、10、11、12、13、14，50 ℃水浴加熱10 min，離心除去不溶物。上清液先用5% H2SO4酸化至pH為3，再用等體積的酸性水溶液（pH=3）稀釋，50 ℃水浴加熱20 min，靜置后離心，所得沉淀經水洗、真空干燥得到熊果酸粗產品。

用HPLC法測定熊果酸含量，計算產品的純度和回收率。

1.3.5.2酸化pH選擇稱取1.3.4.1濾渣干燥物10.0 g，加入95%乙醇200 mL，用超聲波溶解后離心，取上清液，重復3次。合并上清液，以10% NaOH調節(jié)溶液pH值為14，50 ℃水浴加熱10 min，離心除去不溶物。上清液用5% H2SO4分別調節(jié)pH值為1、2、3、4、5、6，再用等體積相同pH酸性水溶液稀釋，50 ℃水浴加熱20 min，靜置后離心，所得沉淀經水洗、真空干燥得到熊果酸粗產品。測熊果酸含量，計算其純度和回收率。

1.3.5.3水稀釋倍數(shù)選擇稱取1.3.4.1濾渣干燥物10.0 g，加入95%乙醇200 mL，用超聲波溶解后離心，取上清液，重復3次。合并上清液，以10% NaOH調節(jié)溶液pH值為14，50 ℃水浴加熱10 min后離心除去不溶物。上清液用5% H2SO4調節(jié)pH值為3，再分別用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5倍溶液體積的相同pH酸性水溶液稀釋，使熊果酸析出并沉降，50 ℃水浴加熱20 min，靜置后離心，所得沉淀經水洗、真空干燥得到熊果酸粗產品。測熊果酸含量，計算其純度和回收率。

1.3.5.4正交試驗稱取1.3.4.1濾渣干燥物10.0 g，加入95%乙醇200 mL，用超聲波溶解后離心，取上清液，重復3次，合并上清液。將上清液根據單因素實驗結果，選擇堿化pH、酸化pH、水稀釋倍數(shù)3個因素進行正交設計，選用L9（34）正交表，因素水平見表1。

表1　正交設計因素水平Table 1　Factors and levels of orthogonal test

1.3.6提取物中熊果酸含量檢測［14—15］色譜條件：色譜柱（Diamonsil C18，250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相由甲醇（標記為 A）和水-冰乙酸-三乙胺（10∶0.03∶0.06，V/V）（標記為 B）兩相組成，A∶B為83∶17（V/V）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長203 nm；柱溫30 ℃；進樣體積20 μL。

對照品溶液制備：稱取熊果酸標準品10 mg，置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，濃度1 mg·mL-1。精密吸取上述溶液1 mL，置于10 mL容量瓶，加甲醇定容，制得終濃度為0.1 mg·mL-1熊果酸對照品溶液。

標準曲線繪制：吸取熊果酸標準品（50、100、200、300、400 μg·mL-1），在上述色譜條件下測定峰高（A），以峰高為縱坐標，以對照品的量為橫坐標，分別繪制標準曲線。

樣品制備：將待測樣用95%乙醇溶解，在常溫4000 r·min-1離心10 min，上清轉移至50 mL蒸餾瓶中，40 ℃水浴旋干，甲醇溶解并定容，搖勻，HPLC上樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得樣品待測溶液。

熊果酸計算方法：Y= （V × X） / G × 10-3

式中：Y-熊果酸含量（mg·g-1）；V-定容體積（mL）；X-熊果酸質量濃度（μg·mL-1）；G-番石榴葉提取物干重（g）。

2　結果與分析

2.1水溶解除雜

2.1.1水用量由圖1可以看出，當加水量少于50 mL時，樣品重量即水不溶物的重量隨用水量增加下降較快，而當加水量超過50 mL后，樣品重量無明顯變化。因此，對于1.0 g樣品，加水量少于50 mL不足以溶解掉其中的水溶性雜質，而水用量過多也會加大工作量。故為了盡可能多的去除掉樣品中的雜質，最終選擇水溶解除雜的料液比為1∶50。

2.1.2離心時間離心時間的長短直接影響著分離效果的好壞。離心時間太短，上清液與沉淀不能很好地分離，造成沉淀的損失；離心時間過長，易造成浪費。圖1顯示，以4000 r·min-1離心10 min，上清液與不溶物基本沒有分離；15 min時分離效果較差，上清液中仍有少量不溶物；20 min以后完全分離，水不溶物重量基本保持穩(wěn)定。

圖1　用水量和離心時間對水不溶物的影響Fig.1　The effects of water dosage and centrifugation time on water-insoluble

2.2石油醚溶解除雜

2.2.1石油醚用量熊果酸不溶于石油醚，因此用石油醚可以除去脂溶性或低極性的雜質，如脂溶性色素等［16］。由圖2可以看出，溶解樣品時隨著石油醚體積數(shù)的增加，過濾后所得樣品的重量在不斷減小，說明其溶出物在不斷增加。當石油醚體積達到100 mL時，不溶物重量變化已不明顯，可能大部分雜質已經被溶解。為提高除雜質的效果，減少石油醚使用量，本實驗嘗試用石油醚多次溶解除雜，以達到盡可能多的去除其他物質的效果。綜合考慮，最后確定石油醚除雜的每次加入量為50 mL，即料液比1∶50。

2.2.2石油醚除雜次數(shù)經過多次溶解后發(fā)現(xiàn)，石油醚溶解液一直保持著綠色，從開始的黑綠色變?yōu)闇\綠色，后面幾次溶解液的顏色則基本不變。說明石油醚很難將樣品中的色素完全去除。

由圖2還可看出，石油醚溶解3次，溶解液的吸光度明顯下降，第二次和第三次分別下降了39.93% 和59.39%。第四次和第五次溶解，溶解液的顏色基本沒有變化，吸光度基本不變。同樣，溶解前三次，樣品的重量和顏色的變化較后兩次明顯。因此，最終確定石油醚溶解除雜的次數(shù)為3次。

圖2　石油醚用量和溶解次數(shù)對石油醚不溶物的影響Fig.2　The effects of dosage of petroleum ether and times of dissolution on petroleum ether-insolution

2.3乙醇溶解次數(shù)

按1.3.4.2的方法確定95%乙醇溶解次數(shù)，結果如圖3。乙醇溶解前3次時，熊果酸的溶解量明顯增加，但當乙醇溶解次數(shù)繼續(xù)增加，熊果酸的溶解量增加不明顯。因此，確定用95%乙醇溶解，按料液比1∶20溶解3次，此時所得溶解物中回收率為95.3%。

2.4酸堿沉降法富集熊果酸的單因素及正交試驗

2.4.1堿化pH對于酸性、堿性或兩性有機化合物，常通過加入酸、堿調節(jié)溶液pH值，以改變分子的存在狀態(tài)（游離型或解離型），從而改變溶解度來實現(xiàn)分離。

圖3　乙醇溶解次數(shù)對熊果酸溶出量的影響Fig.3　The effect of dissolution times on dissolution quantity of ursolic acid

由圖4可知，當堿化pH=14時，熊果酸粗提物的純度達最大，為169.9 mg·g-1，熊果酸回收率為82.76%。綜合考慮堿化pH對產品純度和回收率的影響，選定堿化pH值為14。

2.4.2酸化pH經過一系列酸化實驗證明，酸化pH值對熊果酸的純度和回收率有較大的影響，結果見圖4。在酸化過程中，當pH值從1升高至3時，純度從139.6 mg·g-1升至172.7 mg·g-1，產品的回收率從65.64%升至83.37%。其中pH=3時，產品的純度和回收率均達最大值。故最終選擇酸化pH值為3，并加入相同pH值的酸性水溶液進行稀釋。

2.4.3水稀釋倍數(shù)由圖4可知，酸性水溶液稀釋過程中，用水量是影響產品純度和回收率的重要因素。以1.0倍體積的酸性水溶液稀釋，產品純度較高，為172.7 mg·g-1，且回收率達83.37%。當酸性水溶液大于1.0倍體積后，產品的純度迅速下降，回收率也只緩慢增加到 91.69%。這表明，增大酸性水溶液的體積，有利于熊果酸充分沉淀，同時也造成其他水不溶物的過多析出，降低產品純度。因此，選擇加酸性水溶液稀釋的量為1.0倍樣品體積。

圖4　堿化pH值、酸化pH值和稀釋倍數(shù)對熊果酸純度和回收率的影響Fig. 4　Effects of pH of alkalization， acidification and dilution ratio on purity and recovery of ursolic acid

2.4.4正交試驗酸堿沉降富集熊果酸的正交試驗結果見表2。由分析結果可知，影響酸堿沉降富集番石榴葉熊果酸的主次因素依次為酸化 pH值 ＞ 堿化 pH值 ＞ 水稀釋倍數(shù)；酸堿沉降富集的最佳方案A3B2C2，即以10% NaOH調節(jié)溶液pH值為14，50 ℃水浴加熱10 min，上清液用5% H2SO4調節(jié)pH值為3，再用1.0倍溶液體積pH=3的酸性水溶液稀釋，使熊果酸析出沉降。

表2　正交試驗方案及結果Table 2　Program and results of orthogonal test

2.4.5驗證試驗取番石榴葉乙醇提取物粉末6份各10.0 g，按照優(yōu)選的提取工藝進行試驗。通過本方法的富集熊果酸純度從1.77%提高到17.74%，RSD為1.35%，說明正交試驗確定的提取工藝穩(wěn)定可行。

2.5酸堿富集前后的HPLC圖譜分析

檢測樣品酸堿富集前后的HPLC譜如圖5。結果顯示，經過試驗工藝條件的優(yōu)化，富集物中熊果酸純度得到大幅度提高，乙醇提取物中一些雜質可通過本工藝去除。但富集后粗產品仍有與熊果酸性質相近的其他物質峰，需要進一步采用分離效率高的大孔吸附樹脂法去除（圖5：B）。

圖5　富集前（A）和富集后（B）樣品HPLC圖譜Fig. 5　The HPLC maps of before （A） and after （B） enrichment

3　討論

熊果酸的富集工藝主要有有機溶劑萃取、硅膠柱或交聯(lián)葡聚糖凝膠柱分離富集、酸堿沉降法。前兩種方法工藝成本高，污染嚴重。謝艷［17］在研究白花蛇舌草Hedyotis diffusa熊果酸提取工藝中利用氯仿作為萃取劑，該方法會導致樣品有大量氯仿殘留，給進一步加工成藥品帶來安全性問題；且氯仿的大量使用會造成環(huán)境污染。本研究采用酸堿沉淀法能很好地解決上述問題。張明［18］在提取純化苦丁茶熊果酸時，選用200～300目硅膠裝柱，洗脫劑為氯仿-甲醇體系，這種富集工藝需經過填料-硅膠活化-上樣-預先洗脫去雜質-洗脫-干燥等過程，工藝復雜，上樣和洗脫所需時間過長，成本高。相比較而言，本研究采用的方法工藝簡單，生產周期短。

酸堿沉淀法富集熊果酸的工藝中最常見的問題是溶液體積過大，故本研究采取乙醇多次溶解法，即用95%乙醇按料液比1∶20溶解3次，這樣能更充分地溶解出熊果酸，減少乙醇用量，為后續(xù)處理減少工作量。

在使用石油醚去除雜質、脫色的實驗過程中，即使在石油醚中溶解6次，溶解液仍有顏色，說明雜質沒有完全除盡。如用更多的石油醚除雜質，將增加成本，加重環(huán)境污染，故除雜質方法有待進一步研究優(yōu)化。

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Enrichment Technology of Ursolic Acid in Ethanol Extract from Psidium guajava Leaves

CHEN Chun， LIU Li-qing， CHEN Fei， LIN Zhi-kai， LI Hui-hua， LIU Hong-zhou
（Fujian Key Laboratory of Physiology and Biochemistry for Subtropical Plant， Fujian Institute of Subtropical Botany， Xiamen
361006， Fujian China）

The enrichment technologies of ursolic acid in ethanol extract from Psidium gu ajava leaves were carried out. The results showed that the impurities were separated better with the solid-liquid ratio of 1∶50 of water and 1∶50 of petroleum ether. The conditions of accumulating ursolic acid with acid and alkali were followed as: the solution was treated with 10% NaOH to pH=14，then with 5% H2SO4to pH=3， diluted with aqueous solution with pH=3 as the same volume， the purity and recovery of ursolic acid in the end product were 17.74% and 85.12% respectively.

Psidium guajava leaves； ursolic acid； orthogonal experiment； enrichment technology

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.04.007

Q946

A

1009-7791（2015）04-0297-07

2015-11-13

廈門市科技計劃項目（3502Z20132003）

陳淳，本科，助理研究員，從事植物活性成分研究。E-mail: 275586817@qq.com