彭麗君，溫小芳，黃真池

（1. 嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東湛江524048；2. 嶺南師范學(xué)院應(yīng)用生物技術(shù)研究所，廣東 湛江524048；3. 嶺南師范學(xué)院資源植物工程中心，廣東 湛江524048）

鄧恩桉（Eucalyptus dunnii Maiden）是桉樹屬－雙蒴蓋亞屬（subgenus symphyomyrtus）－藍(lán)桉組（section Maidenaria）－多枝桉系（series Vim inales）中的速生樹種之一[1]，其木材是良好的紙漿材來源。鄧恩桉幼樹相對(duì)其他樹種比較耐寒[2]，因此是培養(yǎng)耐寒桉樹的優(yōu)選品種。在我國(guó)較冷地區(qū)推廣鄧恩桉，不僅有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還能為綠化、增施防護(hù)林、增加木材產(chǎn)量等作出貢獻(xiàn)。

rboh 基因的表達(dá)產(chǎn)物為NADPH 氧化酶，又稱呼吸爆發(fā)氧化酶同源蛋白（respiratory burst oxidase homolog，rboh），是一類以細(xì)胞質(zhì)中的NADPH 為電子供體，將氧催化生成活性氧（reactive oxygen species，ROS）的氧化酶[3]。植物在正常生理代謝過程中會(huì)產(chǎn)生活性氧，這些活性氧一方面可能會(huì)對(duì)植物自身造成氧化傷害[4]，另一方面也可能作為信號(hào)分子參與細(xì)胞周期調(diào)控、程序性死亡、激素信號(hào)、生物和非生物脅迫反應(yīng)及生長(zhǎng)發(fā)育等生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)[5-7]。已有試驗(yàn)表明，rboh 基因在擬南芥[8]、煙草[9-10]、馬鈴薯[11]、水稻[12]及玉米[13]的抗病、抗水分等抗脅迫反應(yīng)中發(fā)揮了重要功能。在桉樹中，rboh 基因的表達(dá)活性與冷脅迫及抗寒機(jī)制有著密切聯(lián)系[14]。研究檢測(cè)了鄧恩桉不同成熟度組織rboh 基因的表達(dá)量，探討了其與鄧恩桉生長(zhǎng)分化的聯(lián)系，以期為培育耐寒桉樹提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

半年生鄧恩桉樹苗（Eucalyptus dunnii Maiden），由湖南森林植物園提供。

1.2 材料的培養(yǎng)與處理

剪取鄧恩桉嫩莖，先用清水沖洗表面灰塵，再用75%酒精表面消毒45 s，然后用20%次氯酸鈉消毒兩次，每次7 m in，最后用無菌水淋洗干凈。將嫩莖切成1 cm 左右的莖段，接種到添加了0.86 μmol/L N-苯基-N- 噻唑基脲（PBU） 和0.57 μmol/L 吲哚乙酸（IAA）的SPCa 培養(yǎng)基中。先暗處培養(yǎng)2 周，再轉(zhuǎn)移至16 h 光照/8 h 黑暗、50 μmol/m2·s 光強(qiáng)、25±2℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 周。

1.3 PCR 分析

1.3.1 總RNA 的提取和反轉(zhuǎn)錄 用手術(shù)刀分別取20 mg 鄧恩桉的成熟葉、不定芽和嫩莖于研缽中研磨。先用1 m l RNAiso-mater for Plant Tissue 處理，再按RNAiso Plua 試劑的操作手冊(cè)提取總RNA，溶于30 μL RNAase-free H2O。在10 μL 反應(yīng)體系中分別加入5×gDNA Eraser Buffer 2 μL、gDNA Eraser 1 μL 和總RNA 1 μg，用RNAase-free H2O 補(bǔ)齊至10 μL 后瞬間離心混勻，30℃反應(yīng)5 min 以去除總RNA 中殘存的基因組DNA。再在上述反應(yīng)體系中依次加入5×PrimeScript Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme M ix I 1 μL、RT Prime M ix 1 μL 和RNAase-free H2O 4 μL，瞬間離心混勻，37℃反應(yīng)15 m in，85℃5 S 使酶失活，所得產(chǎn)物為cDNA。上述所用試劑均為寶生生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3.2 目的基因選擇及引物設(shè)計(jì) 根據(jù)ThePeroxiBase數(shù)據(jù)庫中巨桉過氧化物酶基因的序列，用primer3 plus軟件設(shè)計(jì)qPCR 引物。經(jīng)qPCR 預(yù)試驗(yàn)篩選出3個(gè)擴(kuò)增效率高、特異性好的rboh 基因作為目的基因。根據(jù)黃真池等[15]的研究，選擇RTEF 基因作為內(nèi)參基因。目的基因編號(hào)、引物序列及內(nèi)參基因引物序列見表1。

表1 3種NADPH 氧化酶基因的編號(hào)和引物序列及內(nèi)參基因的引物序列

1.3.3 qPCR 分析rboh 基因 qPCR 反應(yīng)儀器為Chromo 4TMSystem（Bio-Rad）。以cDNA 溶液進(jìn)行qPCR。25 μL 反應(yīng)體系中，添加2 μL cDNA 溶液作模板，每個(gè)反應(yīng)3 次重復(fù)。qPCR 程序?yàn)椋鹤冃?4℃9 s，退火58℃9 s，延伸72℃15 s。40個(gè)循環(huán)后，分析PCR產(chǎn)物的特異性。用Opticon Monitor 3.1 軟件分析各基因的擴(kuò)增效率、Ct 值。設(shè)嫩莖的基因表達(dá)量為1，用相對(duì)定量的Pfaff1 方法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)

嫩莖切段接種在SPCa 培養(yǎng)基中，15 d 后不定芽直接從芽原基處長(zhǎng)出，呈淺綠色（圖1）。50 d 后，不定芽變得較為粗壯，苗莖伸展，葉子大而舒展。

圖1 鄧恩桉萌發(fā)的不定芽

2.2 總RNA 的提取

桉樹組織中多糖、酚類等物質(zhì)含量豐富，嚴(yán)重干擾了RNA 的提取。經(jīng)RNAiso-mate for Plant Tissue 預(yù)處理，再用RNAiso Plus 抽提，均可從鄧恩桉不定芽、嫩莖和成熟葉中提取出高質(zhì)量的RNA。經(jīng)NanoDrop 2000c 紫外分光光度法檢測(cè)，樣品OD260/OD280為1.9～2.05。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，總RNA 條帶清楚、完整，無明顯降解，且無可見的DNA 污染（圖2）。

2.3 rboh 基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增特異性分析

圖2 3種鄧恩桉組織總RNA 的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

由圖3 可知，rboh 基因和內(nèi)參基因的融鏈曲線均只有1個(gè)特征峰值，RTEF、rboh2、rboh3 和rboh4 基因的融鏈溫度分別為82、86、85、82℃，說明qPCR 擴(kuò)增特異性好。

圖3 rboh 基因和RTEF 基因qPCR 融鏈溫度

2.4 rboh 基因表達(dá)

設(shè)嫩莖的基因表達(dá)量為1，qPCR 檢測(cè)得到了鄧恩桉3種不同成熟度組織中rboh2、rboh3 和rboh4 的相對(duì)定量表達(dá)結(jié)果（圖4）。這3個(gè)基因在成熟葉組織中的表達(dá)量最高，嫩莖次之，不定芽的表達(dá)量最低。其中成熟葉中的rboh2 基因的表達(dá)量約為不定芽中的5倍，成熟葉中rboh4 基因的表達(dá)量約為不定芽中的3倍。3個(gè)rboh 基因在不同成熟度組織中的轉(zhuǎn)錄水平由強(qiáng)到弱依次為成熟葉>嫩莖>不定芽。

圖4 鄧恩桉不定芽和成熟葉相對(duì)于嫩莖中的rboh 基因轉(zhuǎn)錄水平

3 結(jié)論與討論

活性氧作為植物的代謝中間產(chǎn)物，不僅影響植物各器官（根、莖、葉、花、果實(shí)、種子）的生長(zhǎng)發(fā)育[16]，并且與其他信號(hào)分子如水楊酸[17-20]、NO[17,21]等共同調(diào)節(jié)植物的各種生理活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)證明，NADPH 氧化酶是植物細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的主要酶類之一[22-27]，即rboh 基因是調(diào)節(jié)植物各種生理活動(dòng)的關(guān)鍵基因。影響rboh 基因表達(dá)的因素有很多，水分脅迫、重金屬脅迫、鹽脅迫、高低溫脅迫等都能影響和調(diào)節(jié)rboh 基因的表達(dá)和ROS 的積累[28]。試驗(yàn)表明，在適宜的生長(zhǎng)條件下，隨著植物生長(zhǎng)發(fā)育程度的不同，rboh 基因的表達(dá)量也會(huì)有所差異，即鄧恩桉rboh 基因的表達(dá)受組織分化程度的影響。

桉樹的抗寒機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，不僅受過氧化物的影響，還受原生質(zhì)膜透性、膜脂成分、保護(hù)酶以及可溶性物質(zhì)等的影響[29]。rboh 基因在鄧恩桉抗寒代謝中是如何起作用的，其是否對(duì)鄧恩桉抗寒代謝起關(guān)鍵作用，這些問題有待于進(jìn)一步開展遺傳轉(zhuǎn)化方面的研究。

[1]林 彥.鄧恩桉組培快繁體系的建立及應(yīng)用[D].北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，2004.

[2]林成立.鄧恩桉扦插繁殖試驗(yàn)[J].福建林業(yè)科技，2005，32（2）：80-84.

[3]林 凡.玉米（Zeamays L.）NADPH氧化酶基因克隆、表達(dá)特性及功能研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[4]Apel K，Hirt H.Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction[J].Annual Review of Plant Biology，2004，55：373-399.

[5]Mittler R，Vanderauwera S，Gollery M，et al.Reactive oxygen gene network of plants[J].Trends in Plant Science,2004，9：490-498.

[6]Foyer C H，Noctor G.Redox sensing and signalling associated with reactive oxygen in chloroplasts，peroxisomes and mitochondria[J].PhysiolPlant，2003，119：355-364.

[7]Fujita M，F(xiàn)ujita Y，Noutoshi Y，et al.Crosstalk between abiotic and biotic stress responses：a current view from the points of convergence in the stress signaling networks[J].CurrentOpinion in Plant Biology，2006，9：436-442.

[8]Kwak JM，Mori I C，Pei Z M，et al.NADPH oxidase AtrbohD and AtrbohF genes function in ROS-dependent ABA signaling in Arabidopsis[J].The EMBO Journal，2003，22（11）：2623-2633.

[9]Simon-Plas F，Elmayan T，Blein JP.The plasma membrane oxidase NtrbohD is responsible for AOS production in elicited tobacco cells[J].Plant Journal，2002，31（2）：137-147.

[10]Yoshioka H，Numata N，Nakajima K，et al.Nicotiana benthamiana gp91phox homologs NbrbohA and NbrbohB participate in H2O2accumulation and resistance toPhytophthora infestans[J].Plant Cell，2003，15（3）：706-718.

[11]KobayashiM，KawakitaK，MaeshimaM，etal.Subcellular localization of Strboh proteinsand NADPH-dependentO2-generatingactivity in potato tuber tissues[J].Journal of Experimental Botany，2006，57（6）：1373-1379.

[12]Yoshie Y，Goto K，Takai R，et al.Function of the rice gp91phox hom-ologs OsrbohA and OsrbohE genes in ROS-dependent plant immune responses[J].PlantBiotechnol，2005，22（2）：127-135.

[13]趙 宇，蔣明義，張阿英，等.水分脅迫誘導(dǎo)玉米Zmrboh基因表達(dá)及ABA在其中的作用[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，3（13）：26-30.

[14]劉 建，項(xiàng)東云，周 堅(jiān).桉樹抗寒生理及分子機(jī)理研究進(jìn)展[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26（5）：81-85.

[15]黃真池，歐陽樂軍，張 龍，等.桉屬植物內(nèi)參基因的篩選及評(píng)估[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，41（10）：67-72.

[16]林植芳,劉 楠.活性氧調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)，2012，47（1）：74-86.

[17]田 敏，饒龍兵，李紀(jì)元.植物細(xì)胞中的活性氧及其生理作用[J].植物生理學(xué)通訊，2005，41（2）：235-240.

[18]Dat JF，F(xiàn)oyer CH，Scott IM.Changes in salilylic acid and antioxidants during Induced thermo to lerance inmustard seedlings[J].PlantPhysiol，1998，118：1455-1461.

[19]Dat JF，Lopez-Delgado H，F(xiàn)oyer C H，et al.Parallel changes in H2O2and catalase during thermo to lerance induced by salicylic acid or heat acclimationmustard seedlings[J].PlantPhysiol，1998，116：1351-1357.

[20]Van Camp W，Van Montagu M，Inze D.H2O2 and NO：redox signals in disease resistance[J].Trends in PlantScience,1998，3：330-334.

[21]BeligniM V，Lamattina L.Nitric oxidestimulatesseed ger-mination and de-etiolation，and inhibits hypocotyl elongation，three light-inducible responses in plants[J].Planta，2000，210：215-221.

[22]蔡以瀅，陳 珈.植物防御反應(yīng)中活性氧的產(chǎn)生和作用[J].生物學(xué)通報(bào)，1991，16（2）：107-112.

[23]LAMBC，DixonRA.Theoxidativeburstin theplantdiseaseresistance[J].Annual Review of Plant physiology and Plant Molecular Biology，1997，48（1）：251-275.

[24]Sagi M，F(xiàn)luhr R.Superoxide production by plant homologue of the gp91phox NADPH oxidase.Modulation of activity by calcium and by tobaccomosaicvirusinfection[J].PlantPhysiol，2001，126（3）：1281-1290.

[25]Zhao ZG，Chen G C，Zhang C L.Interaction between reactivee oxygen species and nitric oxide in drought-induced absciisic acid synthesis in root tips ofWheat seedings[J].Australian Journal or Plant Physiology,2001，28（10）：1055-1061.

[26]Song C J，Steinebrunner I，Wang X Z，et al.Extracellular ATP induces the accumulation of superoxide via NADPH oxidases in Arabidop sis thaliana[J].PlantPhysiol，2006：105.

[27]宮海軍，陳坤明，陳國(guó)倉，等.春小麥葉片質(zhì)膜氧化還原系統(tǒng)及其對(duì)緩慢干旱脅迫的響應(yīng)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（2）：229-234.

[28]Fry S C.Oxidation scission of plant cell wall polysaccharides by ascorbateinduced hydroxyl radicals[J].Biochem Journal，1998，332：507-515.

[29]趙娟娟，洪 偉.我國(guó)桉樹抗寒性研究進(jìn)展[J].福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，25（3）：284-288.