曾秀桃，馬佳鳳，林 穎，朱 晨，王慧敏，徐麗珊

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江 金華321004）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為馬齒莧科一年生草本植物，別名長命草、五行草、瓜子菜、地馬菜等，是我國衛(wèi)生部劃定的87種藥食同源的野生植物之一[1]。其干燥地上部分，性寒味酸，具有清熱利濕、涼血解毒的功效。目前，已有研究表明馬齒莧對多種食品污染菌有較強的抑制作用[2]，以馬齒莧為原料，研制新藥或天然防腐劑已成為一種趨勢。研究馬齒莧抑菌效果的前提是有效提取其抑菌活性成分，而目前提取馬齒莧抑菌活性成份的相關研究較少。

天然產物中有效成分的傳統(tǒng)提取方法有浸漬法[3]、滲漉法[4]、煎煮法和回流提取法[5]等，但這些提取方法存在提取時間長、溶劑用量大、操作麻煩等問題。與傳統(tǒng)提取方法相比，微波輔助萃取有提取快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質量好等優(yōu)點[6]，近年來已廣泛用于天然產物中揮發(fā)油[7]、多糖[8]、生物堿[9]、黃酮[10]等成分的提取。因此，試驗以馬齒莧為試驗材料，通過單因素和正交試驗對其活性成分進行微波輔助萃取研究，旨在獲得最佳提取工藝，為馬齒莧有效成分在食品、制藥等領域的生產應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料與菌種 馬齒莧材料購自菜市場，大腸 桿 菌（Escherichia coli）、 金 黃 色 葡 萄 球 菌（Staphyloccocu saureus）、沙門氏菌（Salmonella）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂15～20 g/L，pH 值7.4～7.6。

1.1.3 主要儀器 微波消解儀（MDS-8G）、MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋（日本三洋電機株式會社）、超凈工作臺（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）、恒溫生化培養(yǎng)箱（SPX-450）、BPG-9070A 電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）、旋轉蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、CT 15RE日立臺式離心機（天美科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗 將新鮮馬齒莧洗凈后烘干至恒重，粉碎備用，以蒸餾水為萃取試劑，以大腸桿菌抑制活性為指標進行單因素試驗設計[11]。（1）微波功率：準確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，料液比1︰50，萃取溫度為50℃、時間為12 m in，分別考察500、600、700、800 W 的微波功率對馬齒莧抑菌活性物質提取的影響。（2）萃取時間：準確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，料液比1︰50，萃取溫度為60℃、微波功率為500 W，分別考察3、6、9、12、15 m in 的萃取時間對馬齒莧抑菌活性物質提取的影響。（3）萃取溫度：準確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，料液比1︰50，微波功率為500 W、萃取時間15 m in，分別考察40、50、60、70℃的萃取溫度對馬齒莧抑菌活性物質提取的影響。（4）料液比：準確稱取400.00 g 馬齒莧植物材料粉末，分別考察1︰30、1︰40、1︰50、1︰60、1︰70、1︰80 的料液比，在溫度為50℃、萃取時間15 m in，微波功率為500 W 的條件下，馬齒莧抑菌活性物質的提取效果。將上述提取液減壓抽濾至25 mg/m L（料液比試驗抽濾至10 mg/m L），測其對大腸桿菌的抑制直徑。

1.2.2 正交試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果，選取萃取溫度、微波功率、萃取時間3個因素進行L（33）正交試驗設計[12]，因素水平選取如表1 所示。并對正交試驗所得的最佳組合進行3 次平行試驗。

表1 正交試驗因素水平

1.2.3 馬齒莧活性成分粗品提取產率計算 在最佳工藝條件下微波萃取得活性成分提取液，將其減壓濃縮后真空冷凍干燥得抑制大腸桿菌活性成分粗品，按公式（1）計算粗品的提取產率。

其中，ω 表示抑制大腸桿菌活性成分粗品提取產率（%）；x 表示粗提物質量（g）；m 表示植物粉末質量（g）。

1.2.4 馬齒莧對細菌的抑制活性及其最小抑菌濃度測定 （1）以蒸餾水為參照，采用牛津杯法[13]測定馬齒莧提取液（50 mg/m L）對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草桿菌的抑制活性。（2）分別制備25、12.5、6.25、3.13、1.56 和0.78 mg/m L 的馬齒莧活性成分溶液，采用牛津杯法則定其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 微波功率 由圖1 可知，隨著微波功率的增加，馬齒莧提取液對大腸桿菌的抑制活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，以700 W 處理得到的馬齒莧提取液對大腸桿菌的抑制直徑最大，達（16.50±0.63）mm。

圖1 不同微波功率獲得的馬齒莧提取液對大腸桿菌抑制活性的比較

2.1.2 萃取時間 由圖2 可知，在萃取3～6 min 時，隨著時間的增加，其提取液的抑菌效果不斷增強，當萃取6 m in 時，抑菌圈直徑達（13.25±0.25）mm；但在萃取6～12 m in 時，萃取時間對馬齒莧抑菌效果的影響差異不顯著。

圖2 不同萃取時間獲得的馬齒莧提取液對大腸桿菌抑制活性的比較

2.1.3 萃取溫度 由圖3 可知，隨著萃取溫度的升高，馬齒莧提取液對大腸桿菌的抑制活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，50℃下獲得的馬齒莧提取液對大腸桿菌的抑制直徑最大，達（13.67±0.46）mm。

圖3 不同萃取溫度獲得的馬齒莧提取液對大腸桿菌抑制活性的比較

2.1.4 料液比 由圖4 可知，隨著料液比比例的增加，提取液的抑菌效果呈現(xiàn)出先增后降的趨勢，當料液比為1︰50 時，抑菌圈直徑最大，達（12.42±0.08）mm。

圖4 不同料液比獲得的馬齒莧提取液對大腸桿菌抑制活性的比較

2.2 正交試驗結果

對表2 的正交試驗結果進行極差分析，極差最大的是萃取溫度（3.24），表明萃取溫度是影響馬齒莧抑菌活性成分提取的主要因素；其次是萃取功率（1.91）；而萃取時間對馬齒莧抑菌活性成分提取的影響最弱。由此可知，對馬齒莧抑菌活性成分提取影響程度從大到小排列依次為：A（萃取溫度）＞C（萃取功率）＞B（萃取時間）。由極差數(shù)值分析可得，最佳萃取條件組合為：A2B2C3，即萃取溫度50℃，萃取時間9 m in，微波功率800 W。

在萃取溫度50℃，萃取時間9 min，微波功率800 W，料液比1︰50 的提取條件下，對馬齒莧抑菌活性成分進行提取，結果表明，該條件下馬齒莧提取物的抑菌直徑分別為13.33±0.44、14.16±0.22、13.67±0.17 mm，均比正交試驗組合的抑菌直徑大，平均值為13.72 mm，標準差為0.42。這表明提取工藝確實為最佳工藝組合。

2.3 最佳提取工藝下馬齒莧抑菌活性成分粗品的得率

表2 正交試驗結果

取馬齒莧植物粉末400.000 g，采用最佳提取工藝（溫度50℃，時間9 m in，功率800 W，料液比1︰50）進行微波萃取，最終制得馬齒莧提取物63.755 g，經(jīng)計算其得率為15.94%。

2.4 馬齒莧提取物對不同細菌的抑制活性及其最小抑菌濃度

由圖5 可知，馬齒莧提取物對沙門氏菌和枯草桿菌無抑制作用，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有抑制作用，其抑菌圈直徑分別為13.00±0.87 mm 和11.25±0.38 mm。

圖5 馬齒莧提取物對不同細菌的抑菌活性比較

從表3 中可以看出，馬齒莧提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌活性隨濃度的增大而增強，并且相同濃度的粗提物對不同供試菌的抑制效果不同，馬齒莧粗提物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度（M IC）分別為6.25 和1.56 mg/m L。這表明馬齒莧對大腸桿菌的抑制效果較強。

3 結論與討論

馬齒莧是一種常見的野菜，在我國分布廣泛，資源豐富，儲量大且安全無毒[14]，同時該野菜還含有豐富的營養(yǎng)成分及多種藥理成分。目前，已被公認是亞麻酸、必需的ω-3 和ω-6 脂肪酸、抗壞血酸、谷胱甘肽、α-生育酚和β-胡蘿卜素等營養(yǎng)成分最豐富的來源[15]。該試驗也證明其對大腸桿菌有較好的抑制作用，在食品、制藥業(yè)等領域的應用潛能較大。

表3 不同濃度馬齒莧提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果

試驗以蒸餾水為萃取試劑，以對大腸桿菌的抑制活性為指標，采用單因素和正交試驗法優(yōu)化了馬齒莧的提取工藝，獲得最佳提取工藝條件為：微波功率800 W，萃取時間9 m in，萃取溫度50℃，料液比1︰50。在此條件下，馬齒莧提取物得率為15.94%，高于紀麗麗等[16-17]獲得的馬齒莧多糖提取率（11.74%）和馬齒莧總黃酮化合物提取率（11.35%）。這表明該工藝提高了馬齒莧中活性物質的提取率，且操作簡便效率高，是理想的提取工藝。

對細菌的抑制活性測定結果表明，馬齒莧對沙門氏菌和枯草桿菌無抑制作用，但對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，最小抑制濃度（M IC）分別為6.25 和1.56 mg/m L，對大腸桿菌的抑制效果強于金黃色葡萄球菌。

上述研究結果可為合理開發(fā)利用植物資源，提高馬齒莧的附加值以及馬齒莧中抑制細菌物質的分離純化提供一定參考。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]朱 丹，牛廣財，孫希云，等.馬齒莧黃酮類物質抑菌作用的研究[J].安徽農業(yè)科學，2006，34（1）：7-8.

[3]魯巍巍，呂德國，李志霞，等.山楂葉總黃酮三種提取方法的比較研究[J].遼寧林業(yè)科技，2008，（5）：9-12.

[4]鐘文武，劉勁松，張聰佴，等.馬蘭化學成分研究（Ⅱ）[J].廣西植物，2012，32（2）：261-263.

[5]何春霞，曹文堯.新疆歐洲鱗毛蕨黃酮的提取及抗氧化活性[J].江蘇農業(yè)科學，2012，40（6）：278-280.

[6]呂俊梅，朱建飛，李 宏，等.微波法提取牛蒡多糖的工藝研究[J].湖南農業(yè)科學，2010，（13）：117-118.

[7]李 昕，聶 晶，高正德，等.超聲微波協(xié)同水蒸氣蒸餾-GC-MS分析南、北五味子揮發(fā)油化學成分[J].食品科學，2014，35（8）：269-274.

[8]Chen Y Z，Zhao L，Liu B G，et al.Application of Response Surface Methodology to Optimize Microwave-assisted Extraction of Polysaccharide from Tremella[J].International Conference on Applied Physicsand IndustrialEngineering，2012，24（1）：429-433.

[9]張 薇，陳浩浩，范華均，等.不同微波輔助法提取苦參生物堿的比較[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（20）：34-38.

[10]張 玉，曾凡坤，吳 劍，等.微波輔助提取柑桔皮渣中類黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，（7）：210-212.

[11]董 璐，代增英，韓 晴，等.茶多酚對大腸桿菌抑菌機理的研究[J].生物學雜志，2015，（1）：72-75.

[12]劉祝祥，王 慧，向 芬，等.臘梅籽脂肪酸提取工藝優(yōu)化及GC-MS分析[J].湖南農業(yè)科學，2012，（3）：80-83.

[13]王熊飛，韓秋菊，高鐸迅.微波法提取山楂多糖的工藝優(yōu)化研究[J].湖南農業(yè)科學，2013，（8）：32-33.

[14]楊迎春，王 強，楊 潔.馬齒莧籽油脂肪酸組成的GC-MS分析[J].食品工業(yè)科技，2014，（14）：147-156.

[15]Alam M A，Juraimi A S，Rafii M Y，et al.Genetic improvement of Purslane（Portulaca oleracea L.）and its future prospects[J].Molecular biology reports，2014，41（11）：7395-7411.

[16]紀麗麗.超聲波輔助提取馬齒莧多糖的工藝研究[J].黑龍江科學，2014，（1）：22-23.

[17]張培宇，盧慶祥，王 芳.微波-超聲波技術協(xié)同萃取馬齒莧中黃酮類化合物[J].中國藥業(yè)，2010，19（21）：34-35.