羅 麗，李 益，葛紅娟，謝玉明，鄧子牛

（湖南農業(yè)大學園藝園林學院、國家柑橘改良中心長沙分中心，湖南 長沙410128）

柑橘潰瘍?。╔anthomonas citri subsp. citri）是一種世界性檢疫性病害，嚴重危害柑橘產業(yè)。而柑橘是我國南方地區(qū)的第一大水果，大多柑橘商業(yè)品種都易感潰瘍病，因此尋找抗病資源、培育抗病商用品種是解決該問題的根本途徑。利用化學誘變處理，定向篩選抗病品種育種方法已廣泛運用在作物改良領域[1-7]，且在禾本植物和草本植物上的應用較多，如水稻[8]、小麥[9]、煙草[10]、香蕉[11-12]、草莓[13]等，在木本植物上應用較少。柑橘屬于木本類常綠果樹，目前應用理化因子誘變獲得其抗性突變體的研究相對較少，大多集中在生態(tài)抗逆方面[14-15]。因此，研究利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯（EMS）對甜橙節(jié)間莖段進行離體誘變，以潰瘍病菌粗提物作為選擇壓來篩選抗性不定芽并進一步將其嫁接成苗，以期探索一條簡單可行的柑橘育種途徑，也為培育柑橘抗病新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料與培養(yǎng)基

以大紅甜橙[C.sinensis（L.）Osbeck]實生苗上胚軸節(jié)間莖段為試驗材料。

培養(yǎng)基由播種培養(yǎng)基（MT＋瓊脂8 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 值5.7），不定芽誘導培養(yǎng)基（MT＋1.0 mg/L 6-BA ＋瓊脂8 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 值5.7），生根培養(yǎng)基（1/2MT＋0.5 mg/L NAA＋0.1 mg/L IBA ＋瓊脂8 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 值5.7）等。

潰瘍病菌重懸液為MT＋1.0 mg/L 6-BA＋瓊脂8 g/L＋蔗糖30 g/L，pH 值5.7；細菌液體培養(yǎng)基為LB 培養(yǎng)基，pH 值7.4。

高純甲基磺酸乙酯（EMS，上海勁馬生物科技有限公司），濃度達99%。

1.2 試驗方法

1.2.1 大紅甜橙實生苗上胚軸的獲得 取大紅甜橙種子，剝去外種皮，用75%酒精表面消毒30 s，再用2%的NaClO 消毒20 m in；消毒后，用無菌水沖洗3 遍以上，在無菌紙上用解剖刀將種子內種皮輕輕劃開，將其播種于播種培養(yǎng)基中；暗培養(yǎng)20 d，再轉光照培養(yǎng)10 d，待用。

1.2.2 EMS 誘變處理方法 用不定芽誘導液體培養(yǎng)基配制體積百分比濃度分別為1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%的EMS 溶液，備用；取大紅甜橙試管苗的上胚軸，切成約1 cm 長的“梯形”節(jié)間莖段；將其浸泡在上述六種濃度的EMS 溶液中，持續(xù)處理時間分別為0.5 h、1 h、2 h，以無菌水代替EMS 作為對照（濃度記為0）；處理結束后加入0.5 m L 的5%硫代硫酸鈉溶液終止反應（待溶液不再渾濁即可），用無菌水沖洗6 遍以上，在無菌紙上吸干多余水分，分別接種于不定芽再生培養(yǎng)基中；每盒20 根，每個處理3 盒，重復3 次；觀察并統(tǒng)計不定芽再生情況，計算不定芽再生率，確定EMS 的半致死劑量（LD50）；以半致死劑量（LD50）處理大紅甜橙實生苗上胚軸節(jié)間莖段，用于下一步抗病突變體的篩選。再生率（%）=（再生數(shù)/接種數(shù)）×100

1.2.3 潰瘍病菌提取液的制備和抗性選擇壓的確定（1）制備潰瘍病菌粗提物。挑取潰瘍病菌單菌落，接種于LB 液體培養(yǎng)基中，28℃，180 r/m in 的條件下培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)至其OD 值為1.0 左右；離心收集潰瘍病菌菌體，用無菌水洗滌1 次后重懸；加入溶菌酶（0.2 mg/m L）在37℃中水浴處理30 m in，用Polytron 勻漿機將菌液勻質化；離心取上清，濃縮10 倍，過濾滅菌待用，即為潰瘍病菌粗提物（XccE）。（2）潰瘍病菌粗提物選擇壓的確定。制備好的XccE 分別以0.5%、1.0%、2.0%、4.0%濃度添加至不定芽誘導培養(yǎng)基中，以不加XccE 為對照。將長約1 cm 的“梯形”節(jié)間莖段接種至添加了XccE 的培養(yǎng)基中，30 d 后觀察并統(tǒng)計莖段不定芽的再生率和再生系數(shù)，確定XccE 的致死劑量（致死劑量下，莖段不定芽相對生長量接近零），以致死劑量作為選擇壓來定向篩選經(jīng)誘變處理后的材料。

1.2.4 抗性突變體的篩選 含XccE 選擇培養(yǎng)基的制備：在不定芽誘導培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基中添加致死劑量的XccE 溶液。用LD50的EMS 處理節(jié)間莖段，無菌水清洗6 遍，接種于含致死劑量的XccE 不定芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待莖段兩端誘導出不定芽（芽＞5 mm），將其從莖段上切下，先轉至MT 培養(yǎng)基中進行復壯培養(yǎng)4 周后，再轉至含致死劑量XccE 的生根培養(yǎng)基中進行離體篩選，對存活下來并生根的不定芽進行編號及復壯培養(yǎng)。

1.2.5 離體接種鑒定 取經(jīng)過復壯培養(yǎng)的不定芽第三片完全展開呈新綠色的葉片，進行針刺接種（不能刺破葉片），在每個傷口處接1μL 潰瘍病菌液，將葉片放置于含有MT 的培養(yǎng)皿上，并與不定芽一一對應編號；對照有3 組：CK，未經(jīng)任何處理直接誘導再生得到的不定芽；TC，保存于種質資源溫室大棚中的大紅甜橙（感病品種）；JY，抗病品種枸櫞C-05；分別接種1 μL 潰瘍病菌和無菌水，觀察葉片感抗病情況。將經(jīng)生物學重復鑒定顯示具有一定抗性的不定芽嫁接至一年生酸橙砧木上使其成活成苗，保存編號。

2 結果與分析

2.1 不同濃度EMS 誘變處理對不定芽再生的影響

從表1 中可以看出，相同處理時間，隨著EMS 濃度的增加不定芽的再生率隨之降低；相同EMS 處理濃度下，隨著處理時間的延長，不定芽的再生率也隨之降低；當EMS 濃度為1.8%，處理時間為2 h 時，不定芽的再生率為對照的一半，由此可知該誘變條件為EMS 誘變劑的半致死劑量（LD50）。

表1 不同濃度EMS 對誘導不定芽再生率的影響

2.2 抗?jié)儾∵x擇壓的確定

把節(jié)間莖段置于含不同濃度XccE 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d 后，觀察統(tǒng)計不同濃度XccE 對不定芽再生率的影響。由圖1 可知，隨著培養(yǎng)基中XccE 濃度的增加，不定芽的再生率隨之降低，再生系數(shù)也隨之降低，而且不定芽的萌發(fā)時間也延長。

圖1 不同濃度XccE 對誘導不定芽再生率的影響

從表2 中可以看出，XccE 濃度為4.0%時，不定芽再生率為21%，但大部分莖段兩端傷口處組織褐化，類似潰瘍病病斑，且在誘導不定芽過程中，其所需時間長且葉片黃又弱，大多數(shù)不定芽的大小在2～5 mm左右，因此認定其相對生長量接近零。因此，以4.0%的XccE 為選擇壓。

表2 不同濃度XccE 對誘導不定芽再生的影響

2.3 抗性突變體的篩選

經(jīng)過EMS 誘變處理后，莖段兩端傷口處絕大部分組織細胞都被殺死，少數(shù)逃逸細胞和突變的細胞經(jīng)誘導再生成不定芽。由圖2 可知，只經(jīng)過誘變處理未經(jīng)過選擇壓選擇培養(yǎng)的B 組不定芽再生率要明顯高于既經(jīng)過誘變處理又經(jīng)過選擇壓選擇培養(yǎng)的D 組再生率；從C 組和D 組來看，C 組不定芽再生率比D 組低，這可能由于未經(jīng)過誘變處理的外植體細胞不抗?jié)儾。m然在分化過程中可能會發(fā)生突變，但是得到突變體的概率很低，而經(jīng)過EMS 誘變處理增加了細胞突變率，在選擇壓的定向選擇下，獲得抗?jié)儾⊥蛔凅w的概率要大得多。最后，經(jīng)過半致死濃度EMS 誘變處理以及選擇壓的選擇培養(yǎng)共誘導再生出1 030個不定芽。

將第一次篩選得到的不定芽進行復壯培養(yǎng)，再轉入含XccE 的生根培養(yǎng)基中進行第二次篩選。從圖3中可以看出，經(jīng)過4%XccE 的第二次篩選，大部分不定芽逐漸黃化、葉片脫落甚至潰爛死亡；有些不定芽雖然葉片黃化，但是沒有出現(xiàn)脫落及潰爛；有些不定芽葉片呈微黃或健康綠色。從這些癥狀可以得出，經(jīng)過誘變及選擇后得到的不定芽表現(xiàn)出的抗病或耐病能力各不相同，經(jīng)過兩次篩選，存活下來487個不定芽。

圖2 甜橙不定芽的誘導再生

圖3 抗性篩選

2.4 離體接種抗?jié)儾¤b定

將不定芽復壯培養(yǎng)4 周后，對其進行離體接種潰瘍病菌的處理。經(jīng)過14 d 的培養(yǎng)觀察，從圖4 中可以看出，在接種潰瘍病菌時，枸櫞C-05 葉片的傷口處褐化，無黃色暈圈，也無突起；大紅甜橙葉片的傷口處先出現(xiàn)水漬圈，逐漸有白白的愈傷組織突起并伴有黃色暈圈，而接種無菌水的枸櫞C-05、大紅甜橙和不定芽葉片均未出現(xiàn)白色愈傷組織或暈圈。因此，當不定芽葉片傷口有突起及黃色暈圈，甚至出現(xiàn)膿狀物時，認為該葉片感潰瘍?。粋跓o明顯變化或出現(xiàn)褐化，并無明顯突起和黃色暈圈時，認為該葉片抗?jié)儾　?/p>

經(jīng)3 次重復，離體接種鑒定篩選到35個抗性芽，將這些抗性芽嫁接于枳砧或酸橙砧木上，獲得突變體株系23 株，目前突變株系在溫室中生長良好。

3 討論

試驗結果表明，隨著EMS 濃度的增加以及處理時間的延長，莖段的存活率、不定芽的再生率都隨之降低，與香蕉[16]、菊花[17]、矮牽牛[18]、大豆[19]等植物中的研究結論一致。突變體的離體篩選，如果只使用單一的化學誘變劑，因其突變方向不定，所獲得的突變體性狀具有較大的隨機性[20]。因此，利用化學誘變劑結合病原菌粗提物的選擇壓力來進行突變體的篩選，可在一定程度上實現(xiàn)定向誘變[21]。

圖4 離體接種鑒定結果

在抗性篩選過程中，只有部分組織細胞接觸到選擇劑，因此在抗性選擇時可能因大部分組織細胞未接觸到選擇劑，而導致出現(xiàn)假陽性材料，從而增加試驗的不確定性。在離體接種抗?jié)儾¤b定時發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)不定芽葉片仍表現(xiàn)感病，這可能如Hartman[22]認為的那樣，在病原菌毒素的選擇壓力下，植物易產生某些生理適應性變異體，一旦選擇壓力消失，這些變異體又會恢復到原來的對毒素敏感狀態(tài)，而且毒素處理后只是少數(shù)細胞發(fā)生突變，難以獲得穩(wěn)定遺傳的抗病突變體；另一方面，因為接種對象是甜橙不定芽的第三片葉，相對自然環(huán)境下完全展開呈新綠色的葉片要更為幼嫩，而接種潰瘍病菌的濃度卻遠遠高出田間潰瘍病的濃度，可能會造成漏篩。為了彌補以上不足，在抗病篩選過程中采取多步定向篩選法可能會更有效。該研究采用兩次不連續(xù)離體篩選法以及離體接種抗性鑒定法，成功地篩選出抗?jié)儾〈痔嵛锏奶鸪韧蛔凅w，這些抗?jié)儾【痔嵛锏脑偕仓陮Σ【目剐院驮谔镩g的抗性程度如何有待進一步研究。

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