常靜，楊淞霖，戴欣，李濟(jì)彤，王會利，瞿唯鋼

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085 2. 中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京100125

5種化學(xué)品對麗斑麻蜥和日本鵪鶉的毒性研究

常靜1，楊淞霖1，戴欣1，李濟(jì)彤1，王會利1，瞿唯鋼2,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085 2. 中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京100125

目前，在化學(xué)品生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)體系中對爬行動物的毒性效應(yīng)研究較少。本研究參考鳥類急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)建立了我國本土爬行動物——麗斑麻蜥(Eremias argus)的急性毒性測試方法，來評價(jià)化學(xué)品對爬行動物和鳥類的毒性效應(yīng)之間的差異。選擇異氰酸酯、1,2-苯并異噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚、苯并噻唑和二苯甲酮5種化學(xué)品分別對麗斑麻蜥進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，并與鳥類模式物種——日本鵪鶉(Coturnix japonica)的急性毒性結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)異氰酸酯和苯并噻唑?qū)惏呗轵? d的半數(shù)致死劑量(7 d-LD50)分別為125 mg·kg-1和500 mg·kg-1，而對日本鵪鶉的7 d-LD50值分別為27 mg·kg-1和37 mg·kg-1；1,2-苯并異噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚和二苯甲酮對麗斑麻蜥的7 d-LD50值分別為909 mg·kg-1、787 mg·kg-1和528 mg·kg-1，而對日本鵪鶉7 d-LD50值均大于劑量上限1 000 mg·kg-1。結(jié)果表明，麗斑麻蜥和日本鵪鶉對相同化學(xué)品的毒性敏感性是存在差異的，用鳥類來評價(jià)化學(xué)品對爬行動物的潛在風(fēng)險(xiǎn)可能不夠準(zhǔn)確，應(yīng)該重視化學(xué)品對爬行動物的毒性效應(yīng)研究。同時(shí)，以本土爬行動物的代表物種麗斑麻蜥作為化學(xué)品環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的模式生物，對保護(hù)我國本土物種及其多樣性、維持生態(tài)平衡具有重要意義。

爬行動物；麗斑麻蜥(Eremias argus)；日本鵪鶉(Coturnix japonica)；急性毒性

爬行動物是脊椎動物的重要組成部分，其種類僅次于鳥類，是第二大類陸地脊椎動物。爬行動物在食物鏈中占據(jù)重要位置，對維護(hù)自然生態(tài)平衡起重要作用。而在脊椎動物環(huán)境毒理學(xué)研究中，很多學(xué)者以鳥類作為模式生物來評價(jià)化學(xué)品對陸生脊椎動物的風(fēng)險(xiǎn)[1]，對爬行動物的研究相對較少，僅有不到1%的研究是關(guān)于爬行動物毒理學(xué)的[2-3]。近年來，爬行動物的種群數(shù)量呈現(xiàn)出嚴(yán)重下降的趨勢，引起了毒理學(xué)家對自然界中爬行動物受污染狀況的廣泛關(guān)注[4]。如研究污染物對鱷魚、海龜和蜥蜴的內(nèi)分泌干擾作用[5]以及爆炸物[6]、有機(jī)磷酸酯類污染物[7]、農(nóng)藥[8-9]和重金屬[10]在蜥蜴體內(nèi)的富集與代謝。

據(jù)美國魚和野生動物保護(hù)協(xié)會統(tǒng)計(jì)，爬行動物種類共計(jì)7 150種，其中蜥蜴物種有5 066種[4]。蜥蜴作為爬行動物中最龐大的家族，是研究爬行動物毒理學(xué)較為理想的模式生物[11]，對蜥蜴的研究就爬行動物而言具較強(qiáng)的代表性。近年來，對蜥蜴毒性的研究僅限于測定蜥蜴體內(nèi)各種農(nóng)藥及重金屬在不同組織中的殘留量[9-10,12-13]，污染物暴露對蜥蜴活動能力、進(jìn)食量和生長的影響[14-15]，對體內(nèi)酶活性的影響[16-17]以及毒物暴露之后對蜥蜴睪丸形態(tài)學(xué)的變化[18]。面對化學(xué)品對爬行動物的毒性數(shù)據(jù)還十分缺乏的現(xiàn)狀，環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估人員在進(jìn)行化學(xué)品對爬行動物的風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)時(shí)經(jīng)常用鳥類來替代[19]。而該建議必須滿足2個(gè)前提條件：第一，鳥類對化學(xué)品的敏感性高于爬行動物；第二，鳥類對化學(xué)品的吸收量大于爬行動物。但是由于蜥蜴獨(dú)特的生理特征和生活習(xí)性，它們對化學(xué)品的敏感度可能與鳥類不一致，甚至高于鳥類，因此亟待開展以蜥蜴作為模式生物的爬行動物毒性測試方法研究。

由于不同的國家和地區(qū)分布的蜥蜴物種不盡相同，各國學(xué)者多圍繞本土的蜥蜴物種展開毒理學(xué)研究。因?yàn)楸就廖锓N易受環(huán)境干擾，對環(huán)境變化更為敏感，能更好地反應(yīng)當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境變化。選用本土物種進(jìn)行毒理學(xué)研究對維護(hù)本地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、維持物種多樣性也具有重要意義。在亞洲，Trinchella等[20]和Alexander等[21]學(xué)者用麗斑麻蜥(Eremias argus)和白條草蜥(Takydromus wolteri)來評價(jià)污染物對爬行動物的影響；在歐洲，Amaral等[22]學(xué)者用意大利壁蜥(Podarcis sicula)做爬行動物毒理學(xué)研究；在北美地區(qū)，近年來由于圍欄蜥蜴(Sceloporus occidentalis)具有體型小、成熟所需時(shí)間較短、易在實(shí)驗(yàn)室繁殖等特點(diǎn)，許多學(xué)者將它作為化學(xué)品環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的受試生物[16,23]。麗斑麻蜥是我國重要的蜥種，隸屬于蜥蜴目、麻蜥屬，以昆蟲為食，廣泛地分布于河北、山西、陜西、內(nèi)蒙古等地區(qū)。選用中國本土爬行物種——麗斑麻蜥作為受試生物評價(jià)化學(xué)品對爬行動物的毒性，對于我國的化學(xué)品環(huán)境管理可能更有意義。

綜上所述，本研究選用我國本土爬行物種麗斑麻蜥為受試生物，在參考鳥類急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，初步建立了基于麗斑麻蜥的化學(xué)品急性毒性測試方法。對異氰酸酯、1,2-苯并異噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚、苯并噻唑和二苯甲酮5種化學(xué)品進(jìn)行麗斑麻蜥急性毒性試驗(yàn)，并與鳥類模式物種——日本鵪鶉(Coturnix japonica)的毒性進(jìn)行對比，為評價(jià)化學(xué)品對爬行動物的毒性提供了科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1器材與試劑

主要器材為30(長) cm×30(寬) cm×20(高) cm和5(長) m×1.2(寬) m×0.4(高) m的玻璃缸；金屬網(wǎng)孔籠，規(guī)格為80(長) cm×50(寬) cm×50(高) cm。異氰酸酯(上海嵐克醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，分析純)；1,2-苯并異噻唑-3-酮、2,4二氯苯酚、苯并噻唑(百靈威集團(tuán)化學(xué)有限公司，分析純)；二苯甲酮(阿拉丁試劑有限公司，分析純)。50 μL進(jìn)樣針以及25 W UVB3.0太陽燈。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

麗斑麻蜥：種源來自于內(nèi)蒙古阿巴嘎旗，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自行飼養(yǎng)與繁殖。在5 m×1.2 m×0.4 m室內(nèi)玻璃缸中飼養(yǎng)，缸內(nèi)鋪蓋10 cm的軟土。溫度控制在(27.5±2.5) ℃，相對濕度為(45%±15%)。使用6盞100 W的白熾燈提供光照并維持光照時(shí)較高的溫度，光暗比控制在14 h:10 h。每天分2次投喂黃粉蟲幼蟲(Tenebriomolitor L.)，每2天提供1次水源，不定時(shí)噴水。每周清理1次脫皮、糞便及食物殘?jiān)?。麗斑麻蜥已在?shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖超過3年，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

日本鵪鶉：購自北京密云興盛養(yǎng)殖場，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室自行飼養(yǎng)與繁殖。日本鵪鶉在14 d齡之前容易出現(xiàn)死亡，在此期間，溫度控制在(35±3) ℃，相對濕度為(60%±10%)。14 d齡后，溫度每天降低1 ℃，最終控制在(25±2) ℃，濕度不變。對于10 d齡之前的幼體鵪鶉的飲用水為溫水，24 h光暗比為20 h :4 h，光照時(shí)間逐日遞減1 h，直至達(dá)到自然光照水平。在進(jìn)入成熟期(30 d齡)后，將日本鵪鶉按雌雄比3:1進(jìn)行分籠飼養(yǎng)。

1.3毒性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)所用麗斑麻蜥來自同一種群，2年齡成熟蜥蜴，體重在(3.5±1.0) g。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的濃度范圍按一定間距設(shè)置5個(gè)劑量組，每組隨機(jī)選擇10只蜥蜴(雌雄各半)，并設(shè)空白對照組，分別放在30 cm×30 cm×20 cm的玻璃缸中。實(shí)驗(yàn)條件與飼養(yǎng)條件一致。試驗(yàn)開始24 h前停止喂食，僅供清水。試驗(yàn)用蜥蜴以經(jīng)口灌胃法一次性給藥5～10 μL·g-1體重，連續(xù)7 d觀察試驗(yàn)用蜥蜴的死亡情況與中毒癥狀，試驗(yàn)期間正常飼喂。記錄各處理組受試蜥蜴的死亡數(shù)，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)，求出LD50值。

日本鵪鶉急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)參照GB/T 31270—2014《化學(xué)農(nóng)藥安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[24]及OECD相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[25]。實(shí)驗(yàn)選擇來自同一批次30 d齡的鵪鶉，體重在(100±10) g。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)劑量組，每組10只鵪鶉，雌雄各半，并設(shè)置空白對照組。各組鵪鶉分別放入金屬網(wǎng)孔籠中。試驗(yàn)前一天停止喂食，僅供清水。供試鵪鶉以經(jīng)口灌注法一次性給藥10 mL·kg-1體重，連續(xù)7 d觀察記錄鵪鶉的死亡情況以及中毒癥狀，求出LD50。

1.4數(shù)據(jù)處理

使用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行Probit線性回歸分析，得到其LD50值。

2　結(jié)果(Results)

對麗斑麻蜥和日本鵪鶉進(jìn)行了5種化學(xué)品的急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，7 d-LD50值的比較結(jié)果如表1所示。

在麗斑麻蜥的急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)口灌胃苯并噻唑、二苯甲酮、1,2-苯并異噻唑-3-酮和2,4-二氯苯酚后，處理組中觀察到麗斑麻蜥出現(xiàn)眼睛緊閉、活動能力減弱的現(xiàn)象，幾個(gè)小時(shí)之后逐漸恢復(fù)。但是發(fā)現(xiàn)蜥蜴進(jìn)食量逐日減少，體重也隨之下降。麗斑麻蜥暴露于500 mg·kg-1的異氰酸酯后，與對照組相比，隨著時(shí)間的延長蜥蜴活動量日益減少，出現(xiàn)嗜睡、精神恍惚、皮膚皺起等現(xiàn)象，有些蜥蜴腹部出現(xiàn)淤青甚至死亡。將死亡的蜥蜴進(jìn)行解剖，發(fā)現(xiàn)部分蜥蜴體內(nèi)出現(xiàn)組織潰爛現(xiàn)象。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，隨著濃度的升高死亡率不斷增加，二者呈良好的S型劑量-效應(yīng)關(guān)系。由SPSS軟件計(jì)算得出異氰酸酯和苯并噻唑的7 d-LD50值分別為125 mg·kg-1和500 mg·kg-1。而二苯甲酮、1,2-苯并異噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚的7 d-LD50值分別為528 mg·kg-1、909 mg·kg-1和787 mg·kg-1。

對日本鵪鶉進(jìn)行了以上5種化學(xué)品的急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中觀察到，與對照組相比鵪鶉在用異氰酸酯和苯并噻唑灌胃后低劑量組沒有明顯的中毒癥狀，但是在高劑量組幾分鐘內(nèi)就出現(xiàn)肌肉震顫、羽毛聳立、頭部下垂等現(xiàn)象，日飲食量也有明顯的減少，體重在不斷下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異氰酸酯和苯并噻唑的LD50值分別為27.4 mg·kg-1和36.8 mg·kg-1，參考《化學(xué)農(nóng)藥安全評價(jià)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則》的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)[24]，異氰酸酯和苯并噻唑?qū)θ毡均g鶉的急性經(jīng)口毒性為高毒。二苯甲酮、1,2-苯并異噻唑-3-酮、2,4-二氯苯酚在上限劑量1 000 mg·kg-1時(shí)，日本鵪鶉都沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，屬于低毒性。

表1　5種化學(xué)品對麗斑麻蜥和日本鵪鶉的7 d-LD50值比較

3　討論(Discussion)

在陸生脊椎動物中，鳥類是重要的受試生物，在目前的化學(xué)品環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)中仍以日本鵪鶉作為陸生脊椎動物的代表物種。然而，由于生物學(xué)特征存在種屬差異，化學(xué)品對于不同近緣種的毒性可能也存在差異，所以化學(xué)品對鳥類的毒性并不一定能夠真實(shí)地反映其對爬行動物造成的影響。近年來，隨著環(huán)境污染的加重，爬行動物數(shù)量在不斷減少，而化學(xué)品對爬行動物的影響卻遭到很多學(xué)者的忽視。目前，環(huán)境污染物對爬行動物的毒性測試還沒有建立標(biāo)準(zhǔn)方法?，F(xiàn)在用于毒性研究的爬行動物主要有蛇、龜和蜥蜴等。但由于蛇和龜?shù)捏w型較大、不易獲得和飼養(yǎng)等特點(diǎn)，不太適合作為毒性測試的模式生物。與之相比蜥蜴被認(rèn)為是理想的受試生物來研究化學(xué)品對爬行動物的毒性。對蜥蜴進(jìn)行毒物暴露的方式主要有經(jīng)皮、經(jīng)口灌胃和經(jīng)口飼喂3種，根據(jù)定量的需要，以經(jīng)口灌胃方式最為常用。本研究采用經(jīng)口灌胃的暴露方式初步建立了麗斑麻蜥的急性毒性測試方法。

本研究對5種化學(xué)品進(jìn)行了麗斑麻蜥和日本鵪鶉的急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果表明，日本鵪鶉對異氰酸酯和苯并噻唑的毒性反應(yīng)敏感性明顯高于麗斑麻蜥，但是二苯甲酮、1,2-苯并異噻唑-3-酮和2,4-二氯苯酚對麗斑麻蜥的毒性明顯高于日本鵪鶉。同時(shí)有研究表明，菊酯類農(nóng)藥作為一種神經(jīng)毒性殺蟲劑對蜥蜴的急性毒性是鵪鶉的374.6倍[26]。環(huán)三亞基三硝胺(RDX)作為一種軍用高能炸藥，對美洲鶉的14 d-LD50為187 mg·kg-1是蜥蜴14 d-LD50的2.6倍[27-28]。蜥蜴對菊酯類農(nóng)藥以及爆炸物RDX表現(xiàn)出更加明顯的敏感性。馬拉硫磷殺蟲劑對鵪鶉的半數(shù)致死劑量LD50為466.5 mg·kg-1，造成20%西部圍欄蜥蜴死亡的劑量為200 mg·kg-1，說明鵪鶉和蜥蜴對馬拉硫磷殺蟲劑的敏感性相當(dāng)[29-30]。已有研究表明，苯并噻唑?qū)π∈蟮募毙越?jīng)口毒性為900 mg·kg-1，屬于中毒，該化學(xué)品對麗斑麻蜥的毒性反應(yīng)敏感性高于小鼠。對水生生物來說，2,4-二氯苯酚對黑頭呆魚的96 h半致死濃度為8.3 mg·L-1，屬于中毒[31]；對溞狀鉤蝦的半致死效應(yīng)濃度為2.48 mg·L-1[32]，屬于中毒。對于2,4-二氯苯酚的毒性效應(yīng)，水生生物比日本鵪鶉更敏感。上述研究結(jié)果表明，對于相同的化學(xué)品，它們對不同的生物表現(xiàn)出不同的急性毒性效應(yīng)。麗斑麻蜥和日本鵪鶉對相同化學(xué)品的毒性敏感性是存在差異的，由于爬行動物特殊的代謝系統(tǒng)和生理特征使得它們可能對化學(xué)品敏感性更強(qiáng)，因而更容易受到影響[21]。本研究進(jìn)一步證明目前用化學(xué)品對鳥類的毒性來評價(jià)其對爬行動物的危害是不準(zhǔn)確的，忽略了對爬行動物這一重大類群的毒性研究。因此，亟待開展化學(xué)品對爬行動物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)研究。

面對化學(xué)品對爬行動物毒性數(shù)據(jù)較為缺乏的現(xiàn)狀，近幾年國內(nèi)外選用本土蜥蜴物種進(jìn)行爬行動物毒理學(xué)研究。對于我國而言，麗斑麻蜥作為本土爬行動物，已實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)?；曫B(yǎng)，是爬行動物毒理學(xué)研究中的理想模式生物。在今后的研究中，我們需要繼續(xù)建立和完善麗斑麻蜥毒性測試方法，積累化學(xué)品對爬行動物的毒性數(shù)據(jù)，將爬行動物逐漸引入到化學(xué)品的毒性評價(jià)體系中。這是服務(wù)于化學(xué)品貿(mào)易中“綠色”技術(shù)壁壘的客觀要求，同時(shí)也對維持生態(tài)平衡以及保護(hù)物種多樣性具有重要意義。

通訊作者簡介：瞿唯鋼(1958)，男，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)藥環(huán)境毒理研究與農(nóng)藥登記管理。

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Toxicity Assessment of Five Chemicals onEremiasargusandCoturnixjaponica

Chang Jing1, Yang Songlin1, Dai Xin1, Li Jitong1, Wang Huili1, Qu Weigang2,*

1. Research Center for Eco-Environmental Science, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China 2. Institute for Control of Agrochemicals, Ministry of Agriculture, Beijing 100125, China

1 February 2015accepted 3 June 2015

Toxicity effects of chemicals have rarely been evaluated in reptiles. In this study, the acute toxicity test method of native reptile-Eremias argus was established in order to evaluate the toxicity of chemicals to reptiles. Eremias argus were exposed to isocyanate, 1,2-benzisothiazolin-3-one, 2,4-dichlorophenol, benzothiazole and diphenylketone respectively in acute oral toxicity test. 7 d-LD50values of lizard were compared with avian model species-Coturnix japonica. According to the results, 7 d-LD50values of isocyanate and benzothiazole to E. argus were 125 mg·kg-1and 500 mg·kg-1while to C. japonica the values were 27 mg·kg-1and 37 mg·kg-1; 7 d-LD50value of 1,2-benzisothiazolin-3-one, 2,4-dichlorophenol and diphenylketone to E. argus were all greater than 1 000 mg·kg-1while to C. japonica the values were 909 mg·kg-1, 787 mg·kg-1and 528 mg·kg-1. The results showed that avian could not be used as surrogate species to reflect the chemical toxicity to reptiles exactly. The toxicity of chemicals to reptiles should be paid more attention. Using native lizard as model animal for reptile ecotoxicology studies will benefit the protection of native reptile species and maintain the ecological balance.

reptile; Eremias argus; Coturnix japonica; acute toxicity

國家自然科學(xué)基金(21477152, 21277163)

常靜(1990-)，女，學(xué)士，研究方向?yàn)槎纠韺W(xué)，E-mail: changjingforever@163.com；

Corresponding author)， E-mail: quweigang111@163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150201001

2015-02-01錄用日期：2015-06-03

1673-5897(2015)6-276-05

X171.5

A

常靜, 楊淞霖, 戴欣, 等. 5種化學(xué)品對麗斑麻蜥和日本鵪鶉的毒性研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(6): 276-280

Chang J,Yang S L, Dai X, et al. Toxicity assessment of five chemicals on Eremias argus and Coturnix japonica [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(6): 276-280 (in Chinese)