胡傳祿，舒耀皋，劉剛，嚴(yán)虎，汪丹，武娟，金昊坤，姚洪偉

上?；ぱ芯吭簷z測中心，上海 200062

四氯丙烯對稀有鮈鯽的急性毒性及安全濃度評價

胡傳祿，舒耀皋，劉剛*，嚴(yán)虎，汪丹，武娟，金昊坤，姚洪偉

上?；ぱ芯吭簷z測中心，上海 200062

采用半靜態(tài)試驗方式測試了四氯丙烯對稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)的急性毒性，試驗濃度分別設(shè)定為0.25 mg·L-1、0.30 mg·L-1、0.36 mg·L-1、0.42 mg·L-1、0.50 mg·L-1和0.60 mg·L-1，同時進行空白對照(試驗用水)和分散劑對照(體積分?jǐn)?shù)為0.006%的吐溫-80水溶液)試驗。采用氣相色譜法對試驗溶液進行濃度分析，實測濃度分別為0.19 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.34 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.51 mg·L-1和0.64 mg·L-1，試驗結(jié)果以實測濃度表示和統(tǒng)計。結(jié)果表明：四氯丙烯致稀有鮈鯽無死亡發(fā)生(EC0)的最高濃度為0.25 mg·L-1，導(dǎo)致稀有鮈鯽100%死亡(EC100)的最低濃度為0.51 mg·L-1。根據(jù)實測濃度，用SPSS(17.0)概率單位法求得四氯丙烯對稀有鮈鯽的半數(shù)致死濃度96 h-LC50為0.347 mg·L-1，95%置信區(qū)間為0.328 mg·L-1～0.361 mg·L-1。

四氯丙烯；稀有鮈鯽；急性毒性；安全濃度

稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)是我國特有的魚種，由于其個體生長快、性成熟時間短、繁殖季節(jié)長而成為我國環(huán)保部推薦的化學(xué)品測試試驗用魚[1-2]。使用我國特有的供試生物進行生態(tài)毒理測試，對于評價化學(xué)物質(zhì)對環(huán)境的影響具有更直接的意義。近年來，使用稀有鮈鯽進行急慢性以及胚胎發(fā)育毒性研究已有報道[3-4]。

氯代烴化合物是一種被廣泛應(yīng)用于制備制冷劑、聚亞胺脂發(fā)泡劑、生物殺蟲劑和聚合物的原料。四氯丙烯是制備化學(xué)除草劑麥畏乳油和新型環(huán)保型制冷劑的主要中間體[5]。以四氯丙烯為原料，可以合成多種具有工業(yè)價值的氟氯化合物[6-7]。它具有揮發(fā)性，在水中不易降解。在化學(xué)品測試導(dǎo)則中屬于難處理物[8]。目前有關(guān)四氯丙烯的毒性研究很少，多以大鼠為實驗對象。Frederick等[9]用大鼠進行了為期4周的經(jīng)口染毒亞慢性試驗，100 mg·kg-1·d-1四氯丙烯及以上濃度組中大鼠出現(xiàn)劑量相關(guān)的體重下降與攝食下降，300 mg·kg-1·d-1四氯丙烯還導(dǎo)致大鼠肝臟病變。Joseph等[10]用四氯丙烯體外染毒大鼠小腸片段30 min后，導(dǎo)致谷胱甘肽含量減少約一半。此外，其對眼睛和皮膚有刺激作用。四氯丙烯對水生生物的毒性研究國內(nèi)外尚未見報道。本文研究了四氯丙烯對稀有鮈鯽的急性毒性，可為評價四氯丙烯對水生生物的影響、制訂廢水排放濃度標(biāo)準(zhǔn)和漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、防治污染和保護漁業(yè)資源等提供參考的依據(jù)。

1　材料與方法 (Materials and methods)

1.1試驗樣品

四氯丙烯，分子式C3H2Cl4，純度≥99.7%，無色液體，密閉、陰涼、干燥保存。

1.2試驗儀器

Agilent7890A型氣相色譜儀，PB-10型pH計，JPBJ-608型覆膜電極溶解氧測定儀，ALB-224 220 g/0.1 mg Ⅰ型分析電子天平，PL403-IC 410 g/0.001 g Ⅱ型電子天平。

1.3試驗用魚

試驗采用稀有鮈鯽(Gobiocypris rarus)為受試魚種，購自中國科學(xué)院水生生物研究所。用于正式試驗之前，在本實驗室中馴養(yǎng)了112 d，適應(yīng)期間該批魚健康，沒有發(fā)現(xiàn)死亡等異?，F(xiàn)象。適應(yīng)期間正常喂食，試驗前24 h停止喂食[11]。馴養(yǎng)期間的條件為水：經(jīng)過砂濾器、炭濾器、微濾器、紫外燈消毒和曝氣后的自來水；光照：每天12 h；水溫：(23±2) ℃；溶解氧濃度：高于空氣飽和值的80%；試驗按照用魚總量的10%抽樣，測其體長為(2.7±0.1) cm，體重為(0.260±0.031) g。參照物重鉻酸鉀對該批稀有鮈鯽急性毒性96 h-LC50值為233.334 mg·L-1，95%置信區(qū)間(192.321 mg·L-1～287.315 mg·L-1)。

1.4試驗用水

試驗用水用經(jīng)過砂濾器、炭濾器、微濾器、紫外燈消毒和曝氣后的自來水。水硬度為110 mg·L-1(以CaCO3計)。暴露在空氣中曝氣后，pH值在8.13到8.14范圍內(nèi)，溶解氧(D.O.)為8.48 mg·L-1到8.86 mg·L-1。

1.5暴露條件

試驗周期：96 h；試驗暴露方式：半靜態(tài)試驗方式(根據(jù)穩(wěn)定性測試結(jié)果，每24 h更換試驗溶液)；負(fù)載量：約為0.25 g魚·L-1；光照：每天12 h(燈光+自然光)；水溫：(23±2) ℃；溶解氧濃度：6.01 mg·L-1～8.89 mg·L-1；飼喂：無。

1.6試驗設(shè)計

根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果，在96 h魚類全部存活的最高濃度(0.25 mg·L-1)到全部死亡的最低濃度(0.60 mg·L-1)的范圍內(nèi)以1.2的公比設(shè)定6個濃度，濃度分別為0.25 mg·L-1、0.30 mg·L-1、0.36 mg·L-1、0.42 mg·L-1、0.50 mg·L-1和0.60 mg·L-1。采用吐溫-80分散溶解的方法配制試驗溶液：稱取0.5012 g四氯丙烯，用吐溫-80溶解定容至50 mL，配制成10 024 mg·L-1的試驗溶液貯備液。用移液管分別移取0.249 mL、0.299 mL、0.359 mL、0.419 mL、0.499 mL、0.599 mL試驗溶液貯備液添加至10 L經(jīng)曝氣充分的試驗用水底部，加蓋后靜置1 h。同時進行空白對照組和分散劑對照組試驗，空白對照組為試驗用水，分散劑對照組為0.6 mL吐溫-80溶解至10 L試驗用水的試驗溶液(吐溫-80體積分?jǐn)?shù)為0.006%)。對照組和試驗組都設(shè)3個平行，每個平行10尾魚。

分別在試驗開始和結(jié)束時測定對照組和濃度組的溶解氧、pH及溫度值，并在96 h暴露期內(nèi)每天測定1次。試驗開始后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h及96 h觀察并記錄試驗魚的死亡及毒性情況。記錄任何明顯的異?，F(xiàn)象(如失去平衡，游泳的行為，呼吸功能，色素沉積等)。

1.7試驗溶液濃度測定

1.7.1定量分析方法

Agilent7890A型氣相色譜儀分析條件為檢測器：ECD；檢測器溫度：300 ℃；載氣：氮氣；色譜柱：HP-5MS，30 m×320 μm×0.25 μm；柱流速：6.5 mL·min-1；進樣口溫度：270 ℃；不分流；進樣量：0.5 μL～2 μL；程序升溫：80 ℃平衡0.5 min，以10 ℃·min-1的速度升至100 ℃，保持1 min。

1.7.2定量分析方法驗證

用正己烷配制四氯丙烯濃度為1.00 mg·L-1、0.50 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.10 mg·L-1、0.05 mg·L-1和0.025 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析各濃度峰面積與濃度的線性關(guān)系，以及儀器精密度。配制0.10 mg·L-1、0.50 mg·L-1和1.00 mg·L-13個濃度梯度的四氯丙烯水溶液，每個濃度重復(fù)2次，根據(jù)每個濃度的平均峰面積求出濃度，并計算回收率。

1.7.3穩(wěn)定性分析

配制1.00 mg·L-1的樣品水溶液，將該溶液放置在與毒性試驗相同的環(huán)境下，分別于0 h及每間隔24 h取樣測定濃度。

1.7.4試驗采樣與濃度分析

分析方法根據(jù)國標(biāo)優(yōu)化而成[12]。采用氣相色譜法測定試驗開始和結(jié)束時、試驗過程中每次換液前后的溶液濃度，各個平行中分別取樣10 mL進行前處理后進行濃度分析。前處理方法為：準(zhǔn)確量取10 mL水溶液于15 mL樣品瓶中，加入2 mL正己烷，搖振3 min后靜置。待分層完全后，根據(jù)各試驗濃度組具體情況，直接取上層有機相測定，或者吸取一定量上層有機相用正己烷稀釋后測定。

1.8數(shù)據(jù)處理

用SPSS(17.0版)概率單位法統(tǒng)計24 h、48 h、72 h和96 h-LC50值及95%的置信區(qū)間。

2　結(jié)果(Results)

2.1四氯丙烯定量分析方法

按外標(biāo)法以每個濃度的平均峰面積對照樣品濃度進行回歸，得回歸線性方程為：y=850945x-14202，R2=0.9996，線性范圍是0.025 mg·L-1～1.00 mg·L-1。精密度和回收率結(jié)果分別見表1和表2。

表1　四氯丙烯定量分析的精密度

表2　四氯丙烯定量分析的回收率

表3　四氯丙烯在實驗中的穩(wěn)定性

表4　四氯丙烯的試驗實測濃度

續(xù)表4

注：*表明未達(dá)到80%～120%的值；新表示新配制的試驗溶液，舊表示換液前或試驗結(jié)束時的試驗溶液。

Note: * means the values not in the range of 80%-120%; New means test solution new prepared, Old means test solution before renewal or at the end of test.

表5　各試驗組四氯丙烯的實測濃度(mg·L-1)

最低濃度0.025 mg·L-1測出的信號與基線噪音信號高度進行比較S/N=441.5，進樣體積為2 μL，以三倍基線噪音得出儀器對該試驗樣品的最小檢出量(LOD)為3.4×10-13g。配制0.001 mg·L-1樣品正己烷溶液，分別重復(fù)進樣6次。計算得到的6次重復(fù)進樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.16%，達(dá)到精密度的要求(一般為<20%)[13]。故最低檢測濃度(LOQ)為0.001 mg·L-1。

2.2四氯丙烯穩(wěn)定性分析

穩(wěn)定性測試的結(jié)果(表3)表明，四氯丙烯的水溶液在48 h內(nèi)能夠維持初始測定濃度的80%～120%。但由于樣品具有揮發(fā)性，為了盡量保持試驗溶液中樣品濃度保持在設(shè)定濃度，魚類毒性試驗采用半靜態(tài)試驗方法，每隔24 h更換藥液。

2.3四氯丙烯濃度測定結(jié)果

根據(jù)測定結(jié)果(表4)，在試驗第48小時和第72小時時0.25 mg·L-1、0.30 mg·L-1濃度組部分試驗溶液濃度沒有達(dá)到設(shè)定濃度的80%～120%，因此試驗結(jié)果采用實測濃度表示，實測濃度采用4次新配制溶液和換液前實測濃度的幾何平均濃度的幾何平均值表示，分別為0.19 mg·L-1、0.25 mg·L-1、0.34 mg·L-1、0.40 mg·L-1、0.51 mg·L-1和0.64 mg·L-1，結(jié)果見表5。

2.4稀有鮈鯽毒性試驗結(jié)果

試驗期間空白對照組和分散劑對照組均未發(fā)生死亡現(xiàn)象，0.19 mg·L-1和0.25 mg·L-1試驗濃度組稀有鮈鯽出現(xiàn)側(cè)翻、失衡中毒癥狀；0.34 mg·L-1和0.40 mg·L-1試驗濃度組稀有鮈鯽出現(xiàn)死亡以及側(cè)翻、失衡、麻痹、癱瘓中毒、游動能力減弱癥狀；0.51 mg·L-1和0.64 mg·L-1試驗濃度組稀有鮈鯽全部死亡。各濃度組的累積死亡率見表6。

2.5四氯丙烯對稀有鮈鯽EC0、EC100及LC50

試驗期間，無死亡發(fā)生的最高濃度為0.25 mg·L-1；導(dǎo)致100%死亡的最低濃度為0.51 mg·L-1；根據(jù)實測濃度，用SPSS(17.0)概率單位法求得該樣品對稀有鮈鯽的半數(shù)致死濃度LC50(24 h、48 h、72 h、96 h)及95%置信區(qū)間見表7。

3　討論(Discussion)

四氯丙烯對稀有鮈鯽的96 h-LC50為0.347 mg·L-1，由此可見，稀有鮈鯽作為我國特有的魚種，對于評價化合物毒性具有很好的靈敏度。按照國家環(huán)保部《環(huán)境監(jiān)測技術(shù)規(guī)范》生物監(jiān)測(水環(huán)境)部分中化學(xué)物質(zhì)對魚類毒性等級的劃分[14]，四氯丙烯屬于劇毒物質(zhì)，在環(huán)境中的排放量應(yīng)加以嚴(yán)格控制。

表6　試驗期間各濃度組中稀有鮈鯽的累積死亡率

表7　四氯丙烯對稀有鮈鯽的LC50及95%置信區(qū)間

環(huán)境中有機污染物的毒性按照作用類型分為麻醉型毒性和反應(yīng)型毒性[15]，麻醉型毒性又分為非極性和極性2種類型，其中非極性麻醉型化合物主要表現(xiàn)為污染物對膜的穿透和破壞作用，基本上不與生物大分子結(jié)合，而極性麻醉型化合物分子結(jié)構(gòu)中含有強失電子基團，如含羥基、氨基的芳烴化合物。四氯丙烯中的雙鍵與氯代基團使其可能成為典型的極性麻醉型化合物。本研究中稀有鮈鯽出現(xiàn)側(cè)翻、失衡、麻痹、癱瘓的中毒癥狀，說明四氯丙烯對稀有鮈鯽確實有麻醉作用。此外，郭遠(yuǎn)明等[16]對另一種氯代烯烴四氯乙烯進行了水生生物毒性研究，推斷四氯乙烯也屬于極性麻醉型化合物。

汪紅軍等[17]研究了四氯乙烯對稀有鮈鯽的急性毒性，96 h-LC50為30.36 mg·L-1，毒性小于四氯丙烯。根據(jù)美國環(huán)保局開發(fā)的EPI Suite軟件預(yù)測，四氯乙烯和四氯丙烯的LogKow值分別為2.97和3.27，由此可見四氯丙烯具有更高的親脂性，可能其更易與魚體內(nèi)的生物大分子結(jié)合，導(dǎo)致其更高的毒性。然而，氯代烴的毒性大小可能還與碳鏈長度、不飽和度、氯代數(shù)量有關(guān)，目前尚未有其他的氯代烴水生生物毒性研究報道，還需進一步通過試驗驗證。

對于水溶液濃度降低的不穩(wěn)定物質(zhì)，可以通過以下方法判斷濃度降低的原因：將新配制的同一樣品水溶液取3份放置在不同的條件下：①光照下容器開放，②光照下容器密封，③黑暗中容器密封。在24 h后分析比較3份水樣的濃度，若②=③>①，說明揮發(fā)是濃度降低的主要因素；若③>②=①，說明光解是濃度降低的主要因素。像四氯丙烯這樣的揮發(fā)性物質(zhì)，在做魚類急性毒性試驗時，可以通過采取密封、減少試驗溶液頂部空間、增加試驗溶液更換頻率等方式減少濃度變化帶來的影響。

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◆

Acute Toxicity Test of Tetrachloropropene to Rare Gudgeon and Determination of Safe Concentration

Hu Chuanlu, Shu Yaogao, Liu Gang*, Yan Hu, Wang Dan, Wu Juan, Jin Haokun, Yao Hongwei

Shanghai Research Institute of Chemical Industry Testing Centre, Shanghai 200062, China

21 April 2015accepted 18 September 2015

The 96 h acute toxicity of tetrachloropropene to freshwater organism rare gudgeon (Gobiocypris rarus) in semi-static exposure regime was measured in this study. The concentration was set as 0.25, 0.30, 0.36, 0.42, 0.50 and 0.60 mg·L-1, as well as a blank control (test water) and a dispersant control (0.006% V/V tween 80). Gas chromatography was used to analyze the test concentrations. The measured concentrations were 0.19, 0.25, 0.34, 0.40, 0.51 and 0.64 mg·L-1, which were used to express and calculate the test results. The result showed that the EC0was 0.25 mg·L-1, and the EC100was 0.51 mg·L-1. According to the measured concentrations, 96 h-LC50of tetrachloropropene to rare gudgeon was 0.347 mg·L-1, with the 95% confidence interval of 0.328 mg·L-1to 0.361 mg·L-1.

tetrachloropropene; rare gudgeon; acute toxicity; safe concentration

上?；瘜W(xué)品公共安全工程技術(shù)中心專項(11DZ2282900)

胡傳祿(1986-)，男，工程師，研究方向為化學(xué)物質(zhì)生態(tài)毒理測試，E-mail: huchuanlu500@163.com；

Corresponding author)， E-mail: lgsds@vip.163.com

10.7524/AJE.1673-5897.20150421004

2015-04-21 錄用日期：2015-09-18

1673-5897(2015)6-313-07

X171.5

A

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