姚恒++方敦煌++肖炳光

摘要：對(duì)抗煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）的煙草品種RBST與紅花大金元（紅大）葉片進(jìn)行黑脛菌接種，采用細(xì)胞生物學(xué)的方法，在不同時(shí)間取樣、染色、顯微觀察，揭示黑脛病菌在抗感葉片時(shí)的侵染動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，接種感病紅大葉片16～20 h，黑脛病菌通過氣孔侵入紅大葉表皮組織，接種48 h后，黑脛病菌長(zhǎng)滿整個(gè)接種小葉盤；而接種抗病RBST葉片24 h后，抗病的RBST葉片才出現(xiàn)極少的壞死斑，隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死斑區(qū)域有少量的擴(kuò)大，但在接種72 h后，壞死面積只占接種小葉盤面積的很小部分。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica var. nicotianae）； 侵染； 動(dòng)態(tài)

中圖分類號(hào)：S432.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4184-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.019

煙草黑脛病的病原為卵菌門疫霉屬煙草疫霉（Phytophthora nicotianae Breda de Haan），嚴(yán)重危害世界各煙區(qū)的煙草生產(chǎn)[1-3]，其不僅侵染煙草成株的莖基部和根部，也侵染葉片和莖中、上部[4-6]。中國(guó)主要煙區(qū)的煙草黑脛病菌為0號(hào)和1號(hào)小種[7]。

煙草黑脛病的防治目前主要采用選育抗病品種、輪作和藥劑防治等措施，選育抗病品種是最直接最有效的方法。目前，我國(guó)也已選育并且從國(guó)外引進(jìn)抗黑脛病的烤煙品種[8-10]。除此之外，改進(jìn)某些栽培措施[11，12]和利用拮抗菌[13-15]的生物防治也能對(duì)煙草黑脛病的發(fā)生取得一定的效果。

煙草黑脛病的研究文獻(xiàn)雖然很多，但是對(duì)黑脛病菌是如何侵染煙草葉片的文獻(xiàn)很少。本研究以感病和抗病的2個(gè)品種進(jìn)行試驗(yàn)，研究了煙草黑脛病菌侵染葉片的動(dòng)態(tài)過程，揭示了病菌是何時(shí)侵染感病煙草葉片、何時(shí)在葉表皮組織中擴(kuò)展，比較了黑脛病菌對(duì)感病、抗病煙草葉片侵染的不同。旨在探討煙草黑脛病侵染葉片的規(guī)律，為煙草黑脛病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種：感煙草黑脛病品種紅花大金元，抗煙草黑脛病品種RBST。煙草黑脛病菌為煙草疫霉菌株119#。培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基（OA）：燕麥30 g、瓊脂15 g、去離子水1 L。稱取新鮮燕麥片30 g，用沙布包起燕麥片扎口加入到1 L去離子水中煮沸2 h，取出沙布將液體補(bǔ)足1 L，加入瓊脂15 g，121.3 ℃高壓15 min分裝待用。

1.2 方法

1.2.1 煙草幼苗的培養(yǎng) 采用二段式育苗方法：將供試煙草品種的種子播種在595孔的漂浮盤上，在12 h光照與12 h黑暗交替、溫度28±1 ℃、濕度70%以上的人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)至煙苗可以連同基質(zhì)一起拔出時(shí)，轉(zhuǎn)移到162孔漂浮盤中在上述人工培養(yǎng)室繼續(xù)培養(yǎng)至6～7葉期（苗齡40～50 d）。

1.2.2 煙苗接種疫霉病菌 離體葉片接種：分別剪取煙株自上而下的第3片，放置于墊有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，利用直徑0.5 cm打孔器將培養(yǎng)基上的黑脛病的菌絲塊打成圓柱塊狀，用小鑷子取菌絲塊黏附在葉片上進(jìn)行侵染。

1.2.3 取樣 按照表1時(shí)間間隔取樣，臨近每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，利用直徑0.5 cm打孔器將菌絲塊侵染部位的小葉盤取下。

1.2.4 染色 臺(tái)盼藍(lán)/苯胺藍(lán)染色 菌絲結(jié)構(gòu)和植物死亡組織細(xì)胞被染成藍(lán)色。儲(chǔ)存液：10 g苯酚、10 mL甘油、10 mL乳酸、10 mL ddH2O、0.02 g臺(tái)盼藍(lán)/苯胺藍(lán)。工作液∶儲(chǔ)存液∶96%乙醇（1∶2，V/V）。透明液∶1 kg 水合氯醛溶解于400 mL去離子水，蓋好蓋子溶解12 h。染色步驟：取下菌絲塊侵染的葉片組織浸沒到臺(tái)盼藍(lán)/苯胺藍(lán)工作液中，沸水水浴1 min，工作液染色過夜。第2天取出染色葉片放入水合氯醛中透明，根據(jù)需要可換幾次透明液，直到樣品變成透明后就可以進(jìn)行鏡檢。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草黑脛病菌從氣孔侵入感病煙草葉表皮

如圖1-a所示，可以清晰的看到煙草黑脛病疫霉菌侵染紅大葉表皮是通過氣孔侵入的。查詢樣本取樣時(shí)間，確定圖1-a為疫霉菌接種16 h的樣品，這說明通過病菌塊接種煙草葉片，疫霉病菌需要經(jīng)過16 h才能開始從煙草氣孔侵入葉表皮中；圖1-b為菌絲塊接種20 h后的樣品圖像，在低倍物鏡下，可以清晰的觀察到大量疫霉病菌從葉表皮細(xì)胞氣孔中侵入葉表皮組織。

通過細(xì)胞學(xué)染色觀察，可以清楚地知道，煙草黑脛病疫霉病菌開始侵入葉片大約需要16～20 h。

2.2 煙草疫霉菌侵染紅大煙草葉表皮的動(dòng)態(tài)

如圖2所示，在接種疫霉菌16 h后，黑脛病疫霉菌開始侵染紅大葉表皮；20～24 h疫霉病菌絲就能夠長(zhǎng)入葉片葉肉組織；30～48 h菌絲數(shù)量逐漸增多，48 h就能長(zhǎng)滿整個(gè)樣品小葉盤；56～72 h菌絲生長(zhǎng)密度進(jìn)一步增大，對(duì)煙葉危害加劇。

比較黑脛病疫霉菌侵染感病煙草紅大葉片的樣品細(xì)胞學(xué)圖片，可以將黑脛病疫霉病菌侵染葉表皮組織分為4個(gè)階段：首先為黑脛病預(yù)備侵染階段，這個(gè)階段為0～16 h。這個(gè)階段黑脛病的菌絲還不能侵入煙草葉表皮，如果要預(yù)防黑脛病菌對(duì)煙葉的危害，在這個(gè)時(shí)期效果最佳。其次是開始侵染階段，這個(gè)階段大約是在接種后16～24 h，這個(gè)階段黑脛病菌已經(jīng)開始從葉表皮的氣孔侵入到葉肉組織內(nèi)，但是疫霉菌絲侵染的程度還比較輕，這個(gè)時(shí)期進(jìn)行噴藥控制應(yīng)該還有效果。再次就是24～48 h，這個(gè)時(shí)期，黑脛病菌絲已經(jīng)在煙葉內(nèi)部進(jìn)行生長(zhǎng)，危害進(jìn)一步加劇。最后一個(gè)時(shí)期48～72 h為重度感染時(shí)期，黑脛病菌絲已經(jīng)長(zhǎng)滿整個(gè)接種小葉盤，這時(shí)期再進(jìn)行防治已經(jīng)失去了意義。

2.3 RBST煙草抗疫霉菌侵染的動(dòng)態(tài)

如圖3所示，在接種疫霉菌24 h后，RBST葉片表面出現(xiàn)極個(gè)別壞死小點(diǎn)；接種36～48 h，RBST葉片表面會(huì)出現(xiàn)個(gè)別的侵染部位，但是區(qū)域很?。唤臃N56～72 h，RBST葉面出現(xiàn)少量壞死斑，但是在低倍視野下進(jìn)一步觀察，這部分壞死區(qū)域只占接種葉盤面積的很少量的部分?？傊?，在接種72 h后，壞死的葉盤面積仍然是占很小的部分。結(jié)果表明，RBST煙草品種的葉片對(duì)黑脛病疫霉菌是高度拮抗的。

3 小結(jié)與討論

不同煙草品種葉片對(duì)黑脛病疫霉菌的抗性有著顯著的差異，煙葉拮抗黑脛病疫霉菌侵染能力與煙草品種自身黑脛病的抗性強(qiáng)弱呈正相關(guān)。常規(guī)鑒定煙草品種黑脛病菌抗性的方法是通過莖部注射接種的方法進(jìn)行的，然后統(tǒng)計(jì)煙草莖部病情指數(shù)及發(fā)病率來評(píng)定煙草品種的抗性級(jí)別。這種鑒定方法的人工操作成本太高，并且受到煙草生長(zhǎng)狀況的限制。從煙葉表皮細(xì)胞圖片可以看出，不同品種煙葉在接種黑脛病菌后，煙葉表皮對(duì)黑脛病菌的侵染呈現(xiàn)相應(yīng)的抗感狀況，并且抗感病情的發(fā)展情況和接種時(shí)間呈現(xiàn)一定程度的正相關(guān)性。如感病的紅大隨著接種黑脛病菌時(shí)間的延長(zhǎng)，黑脛病菌在煙葉葉肉組織中的生長(zhǎng)數(shù)量增加，病情加劇，而抗病的RBST煙草表皮壞死程度也在緩慢增加，表明這種接種黑脛病菌的方法是能夠真實(shí)、有效地反映煙草黑脛病抗性的。接種黑脛病菌為煙草黑脛病的抗性鑒定提供一個(gè)便利且高效的方法，客觀上也將促進(jìn)煙草抗黑脛病品種的選育。

煙草黑脛病的抗性機(jī)理有待于深入的研究。本試驗(yàn)清楚地表明，黑脛病菌是通過氣孔侵入紅大煙草葉表皮組織的。而黑脛病菌卻很少能夠通過RBST的氣孔進(jìn)入到葉表皮組織中；即使黑脛病菌侵染了RBST的葉表皮，RBST又是通過何種機(jī)制來拮抗黑脛病菌在其中的繁殖和生長(zhǎng)的。雖然大量的生理學(xué)證據(jù)表明在寄主植物和病原物非親和性互作（抗病反應(yīng)）和親和性互作（感病反應(yīng)）中酶與植物抗性密切相關(guān)[16-18]。植物體內(nèi)SOD、POD、CAT、PPO、PAL和丙二醛可以作為植物抗病性的生理指標(biāo)，但是這些指標(biāo)并不能從根本上揭示煙草黑脛病的抗性機(jī)理。只有從基因水平上克隆黑脛病菌抗性相關(guān)的基因，并深入的研究抗性基因的功能才能深刻地闡明黑脛病的抗性機(jī)理，進(jìn)而推動(dòng)煙草抗黑脛病品種的選育。

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