龍菊++黃元射+何映霞

摘要：采用微波協(xié)同纖維素酶法提取薯蕷（Dioscorea opposita）多糖，并利用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)選出優(yōu)化的組合因素。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為纖維素酶添加量0.20%、酶解時(shí)間70 min、酶解溫度45 ℃、pH 5.0、微波功率600 W、微波時(shí)間50 s，在此條件下，薯蕷多糖提取含量為30.25 mg/g，明顯高于其他提取方法。

關(guān)鍵詞：薯蕷（Dioscorea opposita）多糖；提取工藝；微波；纖維素酶；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：Q539 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）17-4266-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.17.041

薯蕷（Dioscorea opposita）又名山藥，產(chǎn)量高，營(yíng)養(yǎng)成分全面，含有豐富的碳水化合物和蛋白質(zhì)。薯蕷多糖是薯蕷中一種高效的活性成分，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成[1-3]，具有增強(qiáng)免疫功能，降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等多種生理活性[4，5]。目前，薯蕷多糖的提取方法有微波輔助法、超聲波輔助法、水提取法、索氏提取法和纖維素酶解法等，但均存在提取時(shí)間較長(zhǎng)、提取率較低等缺點(diǎn)[6-8]。為了進(jìn)一步提高薯蕷多糖的提取率，縮短提取時(shí)間，本研究在單因素分析法的基礎(chǔ)上，采用多因素正交分析法，用微波技術(shù)協(xié)同纖維素酶法提取多糖，并對(duì)薯蕷多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在為薯蕷多糖的提取提供一套快速、高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

薯蕷：新鮮薯蕷購(gòu)于貴州省安順市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

主要試劑：纖維素酶、無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚（分析純）；去離子水。

主要儀器：752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、AB204-N型電子天平、DHG-9305AD型電熱恒溫干燥箱、EPP系列微量移液器、粉碎機(jī)、微波爐、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、離心機(jī)、HH-S型恒溫水浴鍋。

1.2 方法

1.2.1 薯蕷多糖提取工藝流程 精確稱取薯蕷粉1.0 g，加入去離子水10 mL，用600 W微波功率處理60 s，再加入0.2%纖維素酶，在50 ℃條件下酶解2 h，提取結(jié)束后抽濾提取液，濃縮到適當(dāng)體積。具體工藝流程：薯蕷→干燥粉碎→稱量→去離子水溶解→微波水浴加熱→纖維素酶→滅活酶→水浴提取→離心取上清液→濃縮。

1.2.2 薯蕷多糖測(cè)定

1）采用苯酚-硫酸法測(cè)定吸光度。

2）檢測(cè)最大吸收波長(zhǎng)。精確吸取0.5 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加去離子水至2.0 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，迅速加入5.0 mL濃硫酸，靜置10 min，充分搖勻后室溫放置20 min。在波長(zhǎng)400～700 nm范圍內(nèi)掃描，用紫外分光光度計(jì)掃描光譜圖。

3）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精確稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖0.10 g，加入去離子水溶解，定容到100 mL，即得100 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取8支具塞試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，5.0 mL濃硫酸，1.0 mL 6%苯酚溶液，用去離子水定容至8.0 mL，靜置10 min，充分搖勻后室溫放置20 min，在最大波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。薯蕷多糖含量的計(jì)算公式：多糖含量（mg/g）=[標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度值（mg）×樣品總體積（mL）]/[樣品的質(zhì)量（g）×取樣體積（mL）]。

1.2.3 微波纖維素酶法提取薯蕷多糖的顯著作用試驗(yàn) 分別精確稱取1.0 g薯蕷粉20份，每5份為一組，共分4組對(duì)薯蕷多糖進(jìn)行提取，分別為：①水浸提法處理組。分別加入10 mL去離子水，60 ℃水浴提取2 h，提取結(jié)束后抽濾提取液，濃縮到適當(dāng)體積。按照苯酚-硫酸法測(cè)定其吸光度，計(jì)算薯蕷多糖含量。②微波提取法處理組。分別加入10 mL去離子水，用600 W微波功率處理60 s，再按水浸提法處理組的方法進(jìn)行操作。③纖維素酶法處理組。分別加入10 mL去離子水，加入0.2%纖維素酶，在溫度50 ℃條件下酶解1 h，再按水浸提法處理組的方法進(jìn)行操作。④微波協(xié)同纖維素酶法處理組。分別加入10 mL去離子水，用600 W微波功率處理60 s，后再加入0.20%纖維素酶，在溫度50 ℃條件下酶解1 h，再按水浸提法處理組的方法進(jìn)行操作。

1.2.4 纖維素酶法提取薯蕷多糖單因素試驗(yàn) 在“1.2.3”中“③”的條件下，通過(guò)改變纖維素酶添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%）、酶解時(shí)間（20、30、40、50、60、70、80、90 min）、酶解溫度（30、35、40、45、50、55、60、65 ℃）、pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5），考察各因素對(duì)薯蕷多糖提取率的影響。

1.2.5 微波法提取薯蕷多糖單因素試驗(yàn) 在“1.2.3”中“②”的條件下，通過(guò)改變微波功率（160、320、480、600、720、840 W）和微波時(shí)間（10、20、30、40、50、60、70 s），考察2因素對(duì)薯蕷多糖提取率的影響。

1.2.6 薯蕷多糖提取率的正交優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)以纖維素酶添加量、酶解溫度、微波功率和微波時(shí)間，按照L16（44）設(shè)計(jì)4水平4因素試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，共16個(gè)組合，3次重復(fù)，確定薯蕷多糖的最佳提取方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖最大吸收波長(zhǎng)

采用苯酚-硫酸法，通過(guò)紫外分光光度計(jì)在400～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，由圖1可以看出，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在490 nm處有最大吸收波長(zhǎng)，因此490 nm為葡萄糖吸光度的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法，通過(guò)在最大吸收波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定葡萄糖吸光度，以葡萄糖濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.013 5x-0.258 3，R2=0.999 6。當(dāng)測(cè)定多糖含量時(shí)，將吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出所測(cè)溶液的多糖含量。

2.3 微波纖維素酶法提取薯蕷多糖的顯著作用試驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，在薯蕷多糖的提取過(guò)程中，提取效率最高的是微波協(xié)同纖維素酶法處理組；其次為微波提取法處理組和纖維素酶法處理組；水浸提法處理組最低。說(shuō)明與其他3種方法相比，微波協(xié)同纖維素酶法可提高薯蕷多糖的提取效率，且提取過(guò)程在1.5～2.5 h就可以基本完成整個(gè)試驗(yàn)。

2.4 纖維素酶法提取薯蕷多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 纖維素酶添加量對(duì)薯蕷多糖提取量的影響 由圖4可知，當(dāng)纖維素酶添加量在0.15%～0.20%時(shí)，薯蕷多糖含量快速增加；當(dāng)纖維素酶添加量為0.25%時(shí)，多糖含量變化比較平緩，變化不大；當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)0.30%時(shí)，多糖含量開(kāi)始減少，其主要原因是多糖與纖維素酶分子達(dá)到飽和狀態(tài)，多糖提取量達(dá)到最大，因此纖維素酶添加量為0.20%時(shí)即可。

2.4.2 酶解溫度對(duì)薯蕷多糖提取量的影響 由圖5可知，隨著溫度升高，薯蕷多糖含量升高，其原因是溫度升高，多糖在水中的溶解度升高。當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí)，薯蕷多糖含量反而下降，主要原因是超過(guò)了纖維素酶的最適溫度。因此纖維素酶法提取薯蕷多糖最佳提取溫度為45 ℃。

2.4.3 酶解時(shí)間對(duì)薯蕷多糖提取量的影響 由圖6可知，纖維素酶在加熱后隨著時(shí)間延長(zhǎng)，薯蕷多糖含量不斷提高；在50～70 min時(shí)，多糖含量變化不大。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)70 min后，多糖含量逐漸減少。因此纖維素酶法提取薯蕷多糖的最佳提取時(shí)間在50～70 min。

2.4.4 pH對(duì)薯蕷多糖提取量的影響 由圖7可知，隨著pH增加，薯蕷多糖含量隨之增加， pH 5.0時(shí)，多糖含量達(dá)到最大值。當(dāng)pH低于或高于5.0時(shí)，影響纖維素酶的活性，從而使多糖提取量降低，因此纖維素酶法提取薯蕷多糖的最適pH為5.0。

2.5 微波法提取薯蕷多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 微波功率對(duì)薯蕷多糖提取量的影響 由圖8可知，隨著微波功率的升高，薯蕷多糖含量逐漸增加，當(dāng)功率達(dá)600 W時(shí)，多糖含量達(dá)到最大值。這是由于功率的升高，加速多糖與水分子之間的運(yùn)動(dòng)，有利于多糖的提取，當(dāng)微波功率超過(guò)600 W時(shí)，分子間的運(yùn)動(dòng)已達(dá)到極值，致使多糖提取量下降。因此選取微波功率600 W。

2.5.2 微波時(shí)間對(duì)薯蕷多糖提取量的影響 由圖9可知，隨著微波時(shí)間的延長(zhǎng)，薯蕷多糖含量開(kāi)始上升，當(dāng)微波時(shí)間為30～60 s時(shí)，薯蕷多糖含量趨于平穩(wěn)，變化不大。因此，微波提取時(shí)間應(yīng)控制在30～60 s較好。

2.6 薯蕷多糖提取工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)薯蕷多糖提取效果影響從大到小依次為纖維素酶添加量、微波功率、酶解時(shí)間、微波時(shí)間。由表3和圖10可知，微波功率和纖維素酶添加量對(duì)多糖提取影響極顯著，酶解時(shí)間有一定影響，微波時(shí)間對(duì)多糖提取的影響最小，因此最優(yōu)工藝組合選取A3B2C4D3，即微波功率為600 W、纖維素酶添加量為0.20%、酶解時(shí)間70 min、微波時(shí)間50 s。在此條件下，薯蕷多糖含量為30.25 mg/g。

3 討論

本研究以薯蕷為研究對(duì)象，探討水浸提法、纖維素酶法、微波提取法、微波協(xié)同纖維素酶法4種方法提取薯蕷多糖的效果，結(jié)果表明微波協(xié)同纖維素酶法為最佳提取方法。利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定微波協(xié)同纖維素酶法最佳提取條件為纖維素酶添加量0.20%、酶解時(shí)間70 min、酶解溫度45 ℃、pH 5.0、微波功率600 W、微波時(shí)間50 s，在此條件下，薯蕷多糖提取含量為30.25 mg/g。微波提取法和纖維素酶法所用微波功率、纖維素酶添加量過(guò)大或酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)均可能造成多糖有效成分分解，從而造成損失。本研究將微波提取法和纖維素酶法2種方法有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，并利用正交試驗(yàn)確定了最佳提取條件，其提取工藝具有操作簡(jiǎn)單、速度快、效率高、質(zhì)量好等特點(diǎn)，是一種有發(fā)展?jié)摿Φ募夹g(shù)，為今后工業(yè)化提取多糖提供了很好的思路。

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