陳悅　李琦　佟長(zhǎng)青　曲敏　李偉

摘要：采用胰蛋白酶對(duì)魁蚶蛋白進(jìn)行不同時(shí)間的酶解，比較酶解產(chǎn)物的抑菌活性。選取抑菌活性較好的胰蛋白酶酶解產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)菌呼吸抑制研究。通過(guò)RP-HPLC對(duì)該酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，采用質(zhì)譜分析其氨基酸序列。結(jié)果表明，胰蛋白酶酶解0.5 h所得到的酶解產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌及希瓦氏菌具有較好的抑菌活性。其抑制金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌的HMP途徑。RP-HPLC分離純化得到了4個(gè)抑菌活性較好的組分。對(duì)其中第2組分進(jìn)行質(zhì)譜分析得到3個(gè)目標(biāo)多肽，其m/z分別為679、792及905，將這3個(gè)目標(biāo)多肽導(dǎo)入De novo Explorer （TM） Software （AB SCIEX； Version 4.1） 進(jìn)行分析，獲得了候選抑菌肽氨基酸序列。

關(guān)鍵詞：魁蚶；酶解產(chǎn)物；抑菌活性；呼吸抑制

抗生素長(zhǎng)期使用不僅會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，而且會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)殘留，破壞動(dòng)物腸道內(nèi)微生物的平衡。尋找一種安全、無(wú)殘留、無(wú)副作用的抗生素替代品成為目前亟待解決的問(wèn)題。研究表明，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可有效抑制細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)甚至包膜病毒[1-2]。Bolscher等人認(rèn)為酶解蛋白法制備抗菌肽可能是生產(chǎn)大量抗菌肽最有前途的方法[3]。

魁蚶（Scapharca broughtonii）屬軟體動(dòng)物門(mén)（Mollusca）、瓣鰓綱（Lamellibranchia）、列齒目（Taxodonta）、蚶科（Arcidae），魁蚶成體個(gè)體肥大，肉嫩味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高，是北方沿海地區(qū)重要的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)之一[4]。張金鈴等研究得到殼聚糖固定化胰蛋白酶對(duì)魁蚶肽的制備的最佳工藝[5]。李偉等研究表明魁蚶中含有一種新的具有廣譜的抗菌活性的防衛(wèi)素[6]。目前，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)貝類(lèi)抗菌肽，但是對(duì)魁蚶抗菌肽研究報(bào)道還很少，且未見(jiàn)對(duì)魁蚶抗菌肽分子量與氨基酸序列的報(bào)道。本研究通過(guò)利用胰蛋白酶酶解不同的時(shí)間，得到的多種酶解產(chǎn)物，并研究其抑菌活性，以期對(duì)魁蚶的開(kāi)發(fā)與利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

魁蚶購(gòu)于大連市長(zhǎng)興水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；革蘭氏陰性菌大腸桿菌ATCC35218（E.coli ATCC35218）、產(chǎn)氣桿菌（C.perfringens ATCC13124）及革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌（S.aureus ATCC25923）及枯草芽孢桿菌（B.subtilis ATCC6633）來(lái)自于遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局、革蘭氏陰性菌希瓦氏菌（Shewanella sp.）由農(nóng)業(yè)部暨遼寧省省級(jí)高校海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；昆明小鼠血紅細(xì)胞來(lái)自于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Sephadex LH-20、胰蛋白酶購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉及牛肉膏購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 魁蚶肉酶解產(chǎn)物的制備 將去殼后的魁蚶肉，加入等體積的0.9% NaCl后用組織粉碎機(jī)勻漿，勻漿后加入2倍體積的0.9% NaCl于4 ℃抽提24 h。抽提液于4 ℃，9 000 r/min條件下離心20 min，棄去沉淀取上清得到可溶性魁蚶蛋白。將得到的可溶性魁蚶蛋白用胰蛋白酶（酶解條件為溫度37 ℃，pH=7.4，加酶量為0.5%）酶解0.5、1、1.5、2及2.5 h，酶解后沸水浴5 min使酶失活，然后于4 ℃，9 000 r/min條件下離心20 min，取上清，冷凍干燥，得到魁蚶肉酶解產(chǎn)物?？廊饷附猱a(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性測(cè)試 利用濾紙片法按照文獻(xiàn)[7]中的方法測(cè)定魁蚶肉酶解產(chǎn)物抑菌活性。

1.2.3 呼吸抑制測(cè)試 分別取30 mL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液、2 mL 1%葡萄糖溶液及2 mL活化后適宜濃度的希瓦氏菌和金黃色葡萄球菌菌懸液，置于測(cè)量瓶中不間斷劇烈攪拌5 min。將溶氧測(cè)定儀傳感器置于混合液中，密封后開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，每間隔1 min記錄一次氧氣濃度，記錄10 min內(nèi)平均溶氧濃度（單位：mg O2/L），計(jì)算出空白氧氣消耗速率。將上述測(cè)量瓶中加入200 μL丙二酸溶液（50 mg/mL，Sodium phosphate）測(cè)定氧氣消耗速率。分別以200 μL磷酸鈉溶液（50 mg/mL）、200 μL碘乙酸溶液（50 mg/mL）、200 μL魁蚶肉酶解產(chǎn)物（10 mg/mL）、200 μL磷酸鈉溶液與200 μL魁蚶肉酶解產(chǎn)物混合液、200 μL碘乙酸溶液與200 μL魁蚶肉酶解產(chǎn)物混合液及200 μL丙二酸溶液與200 μL魁蚶肉酶解產(chǎn)物混合液，代替丙二酸溶液，測(cè)定氧氣消耗速率[8]。

按照文獻(xiàn)[9-10]中的方法，計(jì)算抑菌劑對(duì)細(xì)菌呼吸抑制率IR，以及典型抑制劑對(duì)魁蚶肉酶解產(chǎn)物的疊加抑制率RR。

1.2.4 魁蚶肉酶解產(chǎn)物的分離純化 選擇抑菌活性最好的酶解產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化。將魁蚶肉酶解產(chǎn)物（胰蛋白酶酶解0.5 h）溶于ddH2O配制成30 mg/mL的溶液，8 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，用0.22 μm水膜過(guò)濾，得到樣液。使用C18柱，通過(guò)P230型高效液相色譜儀分離，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，梯度洗脫條件如表1。收集具有抑菌活性的洗脫峰，在通風(fēng)廚揮發(fā)完甲醇后，冷凍干燥，得到魁蚶肉酶解純化物。

1.2.5 肽分子量測(cè)定 利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（5800 MALDI-TOF/TOF）對(duì)具有抑菌活性的魁蚶肉酶解產(chǎn)物的RP-HPLC純化物進(jìn)行分子量測(cè)定。通過(guò)正離子模式下選擇反射方法對(duì)樣品測(cè)試范圍進(jìn)行校準(zhǔn)測(cè)試后對(duì)樣品在正離子模式下選擇反射方法測(cè)試樣品分子量。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)范圍為：1 046.542±05、1 533.858±0.5、2 465.199±0.5及3 494651±0.5。

1.2.6 氨基酸序列測(cè)定 氨基酸序列測(cè)定利用MALDI-TOF/TOF對(duì)RP-HPLC分離純化得到的魁蚶肉酶解純化物從頭測(cè)序（De novo sequencing），首先對(duì)多肽樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）測(cè)試，之后選擇目標(biāo)多肽對(duì)應(yīng)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)試（MS/MS），將二級(jí)碎片離子數(shù)據(jù)導(dǎo)入De novo Explorer（TM）Software（AB SCIEX ；Version 4.1）進(jìn)行分析獲得候選肽段氨基酸序列。

2 結(jié)果與討論

2.1 魁蚶肉酶解產(chǎn)物抑菌活性的測(cè)定

對(duì)胰蛋白酶酶解0.5、1.0、1.5、2.0及2.5 h得到的魁蚶蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。從表2中可以看出，酶解0.5 h的酶解產(chǎn)物抑菌活性較好，能抑制產(chǎn)氣桿菌、金黃色葡萄球菌及希瓦氏菌。此外，不同時(shí)間的酶解產(chǎn)物均能抑制金黃色葡萄球菌，酶解1.0、1.5及2.0 h對(duì)希瓦氏菌也有較弱的抑制活性。

2.2 呼吸抑制測(cè)定

通過(guò)觀(guān)察丙二酸、碘乙酸及磷酸鈉三種典型的糖代謝抑制對(duì)細(xì)菌的呼吸抑制率以及樣品與這3種抑制劑組合后的呼吸抑制率，可以得出樣品對(duì)細(xì)菌的呼吸代謝抑制途徑[8，11]。如表3所示，胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產(chǎn)物與金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌共存時(shí)，均表現(xiàn)出對(duì)希瓦氏菌呼吸代謝的抑制效應(yīng)，且均與磷酸鈉組成的組合抑制劑疊加抑制率最低，抑制金黃色葡萄球菌和希瓦氏菌糖氧化代謝途徑的HMP途徑。

2.3 RP-HPLC分離純化及抑菌活性的測(cè)定

將胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產(chǎn)物通過(guò)RP-HPLC直接進(jìn)行分離純化，并對(duì)其中的部分峰進(jìn)行抑菌活性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

利用基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）對(duì)峰2進(jìn)行從頭測(cè)序（De novo sequencing）。首先對(duì)峰2樣品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜（MS）測(cè)試，之后選擇目標(biāo)多肽對(duì)應(yīng)母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測(cè)試（MS/MS），共得到3個(gè)目標(biāo)多肽，其m/z分別為679、792、905。然后將這3個(gè)目標(biāo)多肽的二級(jí)碎片離子數(shù)據(jù)導(dǎo)入De novo Explorer（TM）Software（AB SCIEX ；Version 4.1）進(jìn)行分析獲得候選氨基酸序列。結(jié)果如表5所示，m/z為679、792、905的多肽，得分70分以上的候選氨基酸序列分別為2、5、5個(gè)。

3 結(jié)論

胰蛋白酶酶解魁蚶蛋白酶解產(chǎn)物的抑菌活性較好。其中胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)氣桿菌、希瓦氏菌抑菌活性都較好，對(duì)金黃色葡萄球菌也表現(xiàn)出抑菌活性。對(duì)呼吸抑制的研究表明，胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產(chǎn)物對(duì)希瓦氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制都是通過(guò)抑制其糖氧化代謝的HMP途徑。對(duì)魁蚶肉酶解產(chǎn)物凝集活性進(jìn)行測(cè)試結(jié)果顯示，胰蛋白酶酶解魁蚶肉的酶解產(chǎn)物的細(xì)菌凝集活性與其抑菌活性沒(méi)有直接關(guān)系。將胰蛋白酶酶解0.5 h的酶解產(chǎn)物通過(guò)RP-HPLC分離純化得到4個(gè)活性組分，測(cè)得峰2分子量792.59。對(duì)峰2進(jìn)行進(jìn)一步研究，得到3個(gè)目標(biāo)多肽，將這3個(gè)目標(biāo)多肽導(dǎo)入De nov Explorer（TM）Software（ABSCIEX ；Version 4.1）進(jìn)行De nove測(cè)序分析，得到候選氨基酸序列。

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Abstract：Scapharca Broughtonii proteins were digested using trypsin for different time， and the antibacterial activities of the obtained hydrolysates were investigated.Inhibition of respiration was carried out using the hydrolysates with stronger antibacterial activities.The hydrolysates were isolated and purified on RP-HPLC column， and the amino acid sequences were analyzed by mass spectrometry.The results showed that the hydrolysates digested by typsin for 0.5 h could better inhibit the growth of Staphylococcus aureus and Shewanella sp.They inhibited Hexose Monophophate Pathway （HMP） of S.aureus and Shewanella sp.Four fractions with better antibacterial activities were isolated and purified on RP-HPLC column.Three peptides found in the 2nd fraction were analyzed by MS/MS， and their m/z were 679， 792 and 905， respectively.The three peptides were analyzed using De novo Explorer （TM） Software （AB SCIEX； Version 4.1） and the candidate amino acid sequences were obtained.

Key words：Scapharca Broughtonii； Enzymatic hydrolysate； Antibacterial acitivity； Inhibition of respiration