王劍雄　鄭興飛　刁英　胡中立

蓮分子生物學(xué)研究進(jìn)展

王劍雄鄭興飛刁英胡中立

柯衛(wèi)東 男，武漢市蔬菜科學(xué)研究所副所長(zhǎng)兼水生蔬菜研究室主任，推廣研究員，享受國(guó)務(wù)院政府特殊津貼，水生蔬菜行業(yè)計(jì)劃及“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃首席專家，主持國(guó)家及省、市重大科研項(xiàng)目多項(xiàng)，《植物遺傳資源學(xué)報(bào)》、《長(zhǎng)江蔬菜》編委。長(zhǎng)期從事水生蔬菜種質(zhì)資源及育種研究，在水生蔬菜種質(zhì)資源保護(hù)及創(chuàng)新、新品種選育、微型種苗繁殖技術(shù)研究與應(yīng)用等方面有創(chuàng)造性貢獻(xiàn)，有力推動(dòng)了我國(guó)水生蔬菜學(xué)科建設(shè)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展。發(fā)表論文、論著100余篇（部），制定農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)9部，取得國(guó)家發(fā)明專利3項(xiàng)，獲國(guó)家科技進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)、第四屆全國(guó)杰出專業(yè)技術(shù)人才獎(jiǎng)等。

蓮（Nelumbo nuciferaGaertn.）屬于蓮科（Nelumbonaceae）蓮屬（Nelumbo Adans），多年生水生宿根草本植物。蓮屬植物僅包含2個(gè)種：中國(guó)蓮（N.nuciferaGaertn.）和美洲黃蓮（N.luteaPers.）。中國(guó)是蓮的起源中心之一，也是蓮最大的栽培地，蓮在我國(guó)栽培有著悠久的歷史。根據(jù)形態(tài)和利用部位，蓮被分為子蓮、花蓮和藕蓮3個(gè)類型。蓮的用途極廣泛，其地下莖稱藕，能食用，葉可入藥，蓮籽為上乘補(bǔ)品，花可供觀賞。在我國(guó)，蓮作為一種重要的水生蔬菜，在生長(zhǎng)發(fā)育、遺傳育種、組培快繁、品種分類等方面已進(jìn)行了大量且深入的研究。近些年來(lái)，很多學(xué)者運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)開展了蓮的品質(zhì)鑒定、遺傳多樣性研究、基因克隆及功能分析等方面的工作，對(duì)深入研究蓮的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝，以及蓮種質(zhì)資源的保護(hù)、發(fā)掘和利用提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

1　蓮DNA分子標(biāo)記技術(shù)

分子標(biāo)記是以個(gè)體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段。分子標(biāo)記具有快速、準(zhǔn)確、多態(tài)性高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用時(shí)能不受環(huán)境、組織部位和其他因素的影響。隨著分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)被應(yīng)用于蓮的親緣關(guān)系分析、品種鑒定、遺傳育種研究及遺傳圖譜構(gòu)建中［1］；主要包括RAPD（Random amplified polymorphic DNA）、AFLP（Amplified fragment length poly-morphism）、SSR（Simple sequence repeats）和ISSR（Inter simple sequence repeats）等［2，3］。

RAPD標(biāo)記是早期蓮應(yīng)用中最廣泛的一種分子標(biāo)記。郭宏波等［4～6］在2004年利用RAPD技術(shù)對(duì)32份蓮品種進(jìn)行了遺傳多樣性研究，擴(kuò)增形成的207條譜帶中多態(tài)帶有193條，占93.23%，顯示該屬植物在我國(guó)具有豐富的遺傳多樣性，且有十分明顯的遺傳分化。之后，又對(duì)野生蓮和千瓣蓮資源進(jìn)行了多態(tài)性分析，結(jié)果均表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。An等［7］在2009年采用RAPD技術(shù)對(duì)我國(guó)18個(gè)省的94份蓮材料進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明蓮具有豐富的遺傳多樣性，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為67.15%。但RAPD技術(shù)在使用的過(guò)程中極易受到各種因素的影響，例如基因組DNA的復(fù)雜度、DNA模板的濃度和質(zhì)量、PCR反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)等，限制了其推廣和使用。

與RAPD相比，SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在已經(jīng)作為理想的分子標(biāo)記廣泛地應(yīng)用于現(xiàn)代分子生物學(xué)的相關(guān)領(lǐng)域。Pan等［8，9］在2007年開發(fā)了11對(duì)蓮SSR引物，在32個(gè)蓮品種中擴(kuò)增出42條多態(tài)性條帶。隨后，利用蓮的EST序列開發(fā)了23個(gè)ESTSSR標(biāo)記，對(duì)39個(gè)栽培中國(guó)蓮、10個(gè)野生蓮及1個(gè)美國(guó)蓮進(jìn)行了遺傳多樣性分析。全志武等［10］在2008年開發(fā)了16對(duì)蓮基因組SSR引物，對(duì)10個(gè)藕蓮?fù)茝V品種進(jìn)行了擴(kuò)增驗(yàn)證，其中6對(duì)引物共擴(kuò)增出15條多態(tài)性條帶，并繪制了10個(gè)品種SSR指紋圖譜。日本學(xué)者Nakao等［11］在2009年用11對(duì)SSR引物對(duì)16個(gè)中國(guó)蓮品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出43條多態(tài)性條帶，可有效地鑒別這些蓮品種，同時(shí)發(fā)現(xiàn)這11對(duì)SSR引物也可以有效地鑒別美國(guó)蓮和中美雜交蓮品種。Liu等［12］在2012年為了評(píng)估11份中國(guó)蓮的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，開發(fā)了11對(duì)SSR引物，擴(kuò)增出41條多態(tài)性條帶，并用這些SSR引物對(duì)71份來(lái)自世界各地具有高度遺傳多樣性的蓮品種成功地進(jìn)行了聚類分析。最近，Yang［13］、Zhang Wei［14］、Li［15］等分別針對(duì)美國(guó)蓮和中國(guó)蓮開發(fā)了SSR引物，為蓮的分子鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜的構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種等方面提供幫助。

ISSR是一種建立于微衛(wèi)星DNA基礎(chǔ)之上的分子標(biāo)記，其開發(fā)成本低、轉(zhuǎn)化率高、多態(tài)性高等特點(diǎn)，使得ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。Han等［16～18］在2007年用基因組中ISSR標(biāo)記分析了華中地區(qū)野生蓮遺傳變異和克隆多樣性，利用核糖體ITS、ISSR和RAPD標(biāo)記分析了38個(gè)蓮品種的遺傳關(guān)系。2009年又用ISSR標(biāo)記對(duì)湖北梁子湖的240個(gè)蓮個(gè)體進(jìn)行了異交率和遺傳多樣性分析。Tian等［19］在2008年利用ISSR標(biāo)記分析了蓮遺傳多樣性和親緣關(guān)系。李長(zhǎng)春等［20］在2011年用8個(gè)ISSR分子標(biāo)記引物對(duì)39份蓮藕品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共擴(kuò)增出89條帶，其中有55條多態(tài)帶，多態(tài)性比率平均為61.8%。通過(guò)遺傳相似系數(shù)和聚類分析，能將39份藕蓮品種完全區(qū)分開，說(shuō)明ISSR標(biāo)記技術(shù)能較好地從分子水平揭示出蓮藕品種的遺傳多樣性。

此外，楊美等［21］在2011年利用AFLP分子標(biāo)記，對(duì)395份花蓮原始種質(zhì)構(gòu)建花蓮核心種質(zhì)資源，以加強(qiáng)對(duì)花蓮種質(zhì)資源的保存、研究和利用。You等［22］在2013年利用葉綠體DNAatpB-rbcL區(qū)序列和AFLP標(biāo)記對(duì)120個(gè)蓮個(gè)體進(jìn)行了遺傳關(guān)系分析，進(jìn)一步研究了野生蓮和栽培蓮的遺傳關(guān)系。Hu等［23］在2012年用AFLP和SSR標(biāo)記對(duì)58份蓮材料進(jìn)行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，以提高育種效率和加強(qiáng)種質(zhì)資源的保護(hù)。

2　蓮功能基因的研究

植物生長(zhǎng)在自然環(huán)境中極易受到各種環(huán)境因素脅迫的負(fù)面影響。近年來(lái)，隨著自然災(zāi)害和人類生活影響的不斷擴(kuò)大，已影響到蓮藕栽培品質(zhì)和產(chǎn)量［24］，所以，近些年蓮的耐脅迫相關(guān)基因的研究相對(duì)比較集中。超氧化物歧化酶（SOD）在植物中普遍存在，SOD能夠增強(qiáng)植物在逆境中抵抗活性氧脅迫的能力。朱虹琳等［25］、Dong等［26］對(duì)蓮銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）基因進(jìn)行了克隆和序列分析。董臣等［26～29］在2010年克隆了蓮抗氧化相關(guān)的四個(gè)基因：MnSOD、CuZnSOD、APX和CAT，研究表明蓮抗氧化基因在面對(duì)短期脅迫時(shí)具有協(xié)同作用。李國(guó)林等［30］2010年采用SMART技術(shù)成功構(gòu)建了藕蓮和花蓮頂芽的cDNA文庫(kù)，為蓮相關(guān)功能基因的克隆提供了序列資源。同時(shí)克隆并分析了NnGPXl和蓮泛素轉(zhuǎn)運(yùn)酶 NnUBC，對(duì)蓮進(jìn)行冷、熱、機(jī)械損傷、高鹽、ABA、PEG等不同時(shí)間梯度的脅迫處理，發(fā)現(xiàn)NnGPXl和NnUBC表達(dá)水平在各種處理后都迅速升高，說(shuō)明其在蓮生長(zhǎng)發(fā)育和面對(duì)脅迫環(huán)境時(shí)起著重要的調(diào)節(jié)作用。Diao等［31］在2014年克隆了蓮谷胱甘肽過(guò)氧化酶（NnGPX）基因，并證明了蓮谷胱甘肽過(guò)氧化酶具有耐鹽性。除了以上這些脅迫相關(guān)基因以外，還有蓮種子防御素基因、蓮小分子熱激蛋白基因sHSP17.5、多酚氧化酶基因和CBF2基因已經(jīng)被克?。?2～36］，且均被證明和蓮的抗逆性和脅迫相關(guān)。以上關(guān)于蓮抗逆性和脅迫相關(guān)基因的研究對(duì)提高蓮在脅迫環(huán)境中的生命力有一定的促進(jìn)作用。

除了脅迫相關(guān)基因以外，與蓮淀粉合成相關(guān)的基因研究是當(dāng)下學(xué)者研究的重點(diǎn)。以淀粉為主的碳水化合物是影響蓮產(chǎn)量和加工品質(zhì)的主要因素，所以研究蓮淀粉相關(guān)基因?qū)ι彯a(chǎn)量和蓮產(chǎn)品的加工都具有一定的幫助。Lu等［37］在2012年從蓮品種“美人紅”中克隆了調(diào)控直鏈淀粉合成的顆粒結(jié)合淀粉合成酶 （Granule-bound starch synthase，GBSS）基因，并用Real-time PCR進(jìn)一步地分析了GBSS基因在淀粉合成方面的功能。Cheng等［38］在2014年也從“美人紅”品種中克隆出了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）基因序列，并進(jìn)一步證實(shí)了AGPase是控制淀粉合成的關(guān)鍵酶。張莉等［39］在2015年克隆得到LrSSS（可溶性淀粉合成酶Soluble starch synthase，SSS）cDNA序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)作了初步分析。以上這些研究結(jié)果為蓮淀粉合成代謝及分子機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

另外，Wu等［40］在2014年克隆了蓮中苯丙氨酸氨裂解酶基因（NnPAL1），并對(duì)其進(jìn)行了功能鑒定和分子進(jìn)化分析，為被子植物的PAL蛋白家族的進(jìn)化提供了新的見解。

以上的研究?jī)H是關(guān)于蓮基因克隆和表達(dá)模式的初步分析，未涉及基因的生物功能的詳細(xì)闡述。目前僅有的生化功能研究來(lái)自對(duì)蓮sHSP17.5基因的研究，證明了sHSP17.5基因在擬南芥異源表達(dá)中提高了擬南芥的耐熱性［34］。

3　蓮測(cè)序的研究

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，基因組測(cè)序變得越來(lái)越容易。中國(guó)古代蓮的基因組測(cè)序工作由中國(guó)科學(xué)院武漢植物園在2013年5月完成，并釋放了基因組數(shù)據(jù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/？val= AQOG01）［41］。同年武漢蔬菜研究所也公布了蓮基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，并分析找出了與蓮種子長(zhǎng)期存活和淀粉合成相關(guān)的基因，對(duì)開花植物的進(jìn)化提供了新的見解［42］。此外，全志武等［43］在2011年對(duì)中國(guó)蓮和美洲蓮葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序，對(duì)比兩組葉綠體基因組序列，開發(fā)了蓮細(xì)胞器基因組分子標(biāo)記，并結(jié)合其他80種植物葉綠體基因組序列，對(duì)蓮屬系統(tǒng)進(jìn)化地位進(jìn)行了分析。Cheng等［44］和Kim等［45］在2013年分別對(duì)不同蓮地下莖發(fā)育時(shí)期和部位進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找到了控制蓮藕地下莖發(fā)育的關(guān)鍵基因。Wu等［46］在2014年對(duì)蓮葉綠體基因組進(jìn)行了精確的測(cè)序分析，為雙子葉植物質(zhì)體進(jìn)化分析提供了新的見解。游永寧等［47］在2015年分別將野生花蓮和栽培藕蓮的轉(zhuǎn)錄組通過(guò)Illumima測(cè)序和組裝，并據(jù)此開發(fā)了蓮的EST-SSR標(biāo)記。

目前，蓮的基因組學(xué)才剛剛起步，但已經(jīng)得到了廣泛的關(guān)注。蓮的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化研究、分子標(biāo)記開發(fā)、基因功能的驗(yàn)證等具有重大意義。

4　蓮屬染色體核型分析

蓮屬的兩個(gè)種都是二倍體，染色體數(shù)目為2n= 16，具有8對(duì)染色體。王寧珠等［48］在1985年對(duì)20個(gè)蓮品種進(jìn)行了體細(xì)胞染色體的形態(tài)和核型分析，發(fā)現(xiàn)所有的品種都是二倍體。黃秀強(qiáng)等［49，50］和刁英等［51，52］分別對(duì)美洲黃蓮和中國(guó)蓮進(jìn)行了核型分析，得出蓮核基因組大小約為950 Mbp的結(jié)果，其8條染色體在中期時(shí)總長(zhǎng)約18 μm，其中最長(zhǎng)的1號(hào)染色體長(zhǎng)達(dá)4.7 μm。在8對(duì)染色體中，第1、5對(duì)染色體形態(tài)為近端著絲點(diǎn)，第4、6、7對(duì)為近中部著絲點(diǎn)，第2、8對(duì)為中部著絲，第4、5對(duì)染色體上有隨體結(jié)構(gòu)。美洲黃蓮的核型不對(duì)稱系數(shù)為70.82%，中國(guó)蓮的不同品種的核型不對(duì)稱系數(shù)也在70%左右，所以蓮為不對(duì)稱核型。Diao等［53］利用分子核型和5S核糖體RNA基因間隔序列證明蓮屬物種遺傳多樣性是有限的，美國(guó)蓮被視為中國(guó)蓮的亞種更為合適。染色體核型分析為分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究提供了基礎(chǔ)，是研究蓮的分類、演化以及染色體結(jié)構(gòu)、形態(tài)與功能所不可或缺的重要手段。

5　展望

我國(guó)蓮研究起步相對(duì)較早，分子生物學(xué)研究也得到了大力的發(fā)展。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，可以從分子水平對(duì)蓮的基因功能、性狀表達(dá)、遺傳變異的機(jī)制進(jìn)行闡明，加速了蓮新品種選育，對(duì)促進(jìn)蓮產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、提升蓮產(chǎn)業(yè)的整體競(jìng)爭(zhēng)力有重大意義。目前限制蓮分子生物學(xué)研究的瓶頸和亟待解決的熱點(diǎn)問題主要包括：與功能基因連鎖的分子標(biāo)記的開發(fā)和利用，以及轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的建立。

5.1與功能基因連鎖的分子標(biāo)記的開發(fā)和利用

DNA分子標(biāo)記的開發(fā)是近幾年來(lái)蓮分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，目前用該方法在蓮的種質(zhì)資源分類和鑒定、遺傳多樣性研究、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面都已經(jīng)取得了大量的研究進(jìn)展。但在蓮的育種方面可以開發(fā)出與功能基因連鎖的標(biāo)記，直接篩選出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗病的蓮新品種，實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。蓮具有豐富的種質(zhì)資源，在分子生物學(xué)和相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展下，有望克服育種過(guò)程中的相關(guān)難點(diǎn)，縮短蓮品種選育周期，更有針對(duì)性地培育出所需要的蓮品種。

5.2轉(zhuǎn)基因平臺(tái)的建立

目前，關(guān)于蓮的轉(zhuǎn)基因尚未被報(bào)道，其原因主要有兩點(diǎn)：其一是植物轉(zhuǎn)基因是基于植物胚性愈傷培養(yǎng)基礎(chǔ)上的，到目前為止，僅有何子燦等［54］在1987年用花蓮胚性愈傷誘導(dǎo)分化出組培苗，刁英等［55］在2011年以鄂藕雜3號(hào)蓮藕頂芽或側(cè)芽的莖尖為外植體誘導(dǎo)胚性愈傷組織成功，并分化出幼苗，但胚性愈傷分化成苗率十分低。之后一直沒有關(guān)于蓮胚性愈傷的相關(guān)報(bào)道；其二是蓮基因組序列的測(cè)序結(jié)果在2013年5月才公布。植物組織培養(yǎng)技術(shù)和清晰的遺傳背景是轉(zhuǎn)基因工作開展的基石，雖然以上兩個(gè)原因使蓮的轉(zhuǎn)基因研究一直處于擱淺狀態(tài)，但相信蓮的基因組序列的公布將推進(jìn)蓮轉(zhuǎn)基因研究和探索工作。

上述問題是阻礙蓮分子生物學(xué)研究進(jìn)程的瓶頸，是目前最有可能克服的難題，也是今后一段時(shí)間蓮分子生物學(xué)亟待解決的熱點(diǎn)問題。

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10.3865/j.issn.1001-3547.2015.18.014

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目資助（編號(hào)：2012BAD27B01）

王劍雄，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，430072，E-mail：214065995@qq.com

鄭興飛，刁英，胡中立，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

2015-07-16