張燕，修心宇（長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶涪陵，408100）

莖瘤芥種子和葉片中硫苷的提取與純化

張燕，修心宇
（長江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶涪陵，408100）

研究了不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）、提取時間（10、15、20、25 min）、提取溫度（50、60、70、80℃）對莖瘤芥種子和葉片中硫苷提取量的影響。試驗結(jié)果表明，種子與葉子的硫苷在質(zhì)譜儀中出峰時間均在1 min內(nèi)，種子內(nèi)的硫苷含量和純度均高于葉片。當料液比為1∶15（g∶mL）、溫度70℃、時間20 min時，提取的硫苷量最大。

莖瘤芥；硫代葡萄糖苷；提取；純化

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡稱硫苷）是一類含硫次級代謝物，多數(shù)分布在海綿體、高等植物、紅棗等450多種生物中，在蕓薹屬植物中含量最高［1，2］。在已發(fā)現(xiàn)的120多種硫苷中［3，4］，十字花科植物含有62種，其中有19種在蕓薹屬作物中被檢測出。硫苷本身較為穩(wěn)定，細胞液泡中含量最高，當植物體遭遇傷害時，硫苷會降解［5］，減緩傷害作用。硫苷及其降解產(chǎn)物的生化特性較為活躍，在抗癌領(lǐng)域已吸引了眾多研究者的關(guān)注，并得到了廣泛的認同［6～8］。研究發(fā)現(xiàn)，食用十字花科蔬菜可以降低癌癥的發(fā)病率，減少癌癥對人體健康的危害［9～14］。

20世紀70年代以前，主要是利用紙色譜和薄層色譜法對硫苷進行分離［15］。20世紀90年代后，硫苷的分析方法主要是高效色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS），但這種方法要對樣品原料實施脫硫處理，消耗的時間較長。而反相離子對色譜的出現(xiàn)，解決了上述種種問題，成為一種較為理想的分離方法。

十字花科植物中硫苷及其降解產(chǎn)物的生物活性極其活躍，在抗腫瘤和抑菌活性領(lǐng)域已得到眾多研究者的關(guān)注和證實。莖瘤芥 （Brassica juncea（L.）Czern.et Coss.var.tumidaTsen et Lee）為十字花科蔬菜，目前未見莖瘤芥內(nèi)硫苷提取、純化的報道。因此，以莖瘤芥的種子和葉片為材料，對二者所含硫苷進行提取和分化，為其抗癌領(lǐng)域的應(yīng)用提供支撐。

1　材料與方法

1.1試驗材料

莖瘤芥種子，儲藏期3 a，由重慶市涪陵綠原農(nóng)業(yè)科技發(fā)展公司提供；葉片，購于涪陵超市，品種名稱均為永安小葉。

1.2試驗儀器

KH-250DB型數(shù)控超聲波清洗器，南京溫諾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；Xevo G2-S QTof質(zhì)譜儀，沃特世科技（上海）有限公司生產(chǎn)；RE-52C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，西安博奧儀器有限公司生產(chǎn)；LGJ-10型真空冷凍干燥機，MIT三豐儀器科技有限公司生產(chǎn)。

1.3試驗方法

①工藝流程莖瘤芥葉片清洗、風(fēng)干→將種子、葉片在電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥→研成粉末→乙醚脫脂→甲醇提取→離心取上層清液→真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去甲醇→質(zhì)譜儀檢測→葡聚糖凝膠離子交換柱除雜→色譜儀純化→真空冷凍干燥機濃縮。

②試驗前處理莖瘤芥種子和葉片購回后，將葉片洗凈，并用細線串聯(lián)起來，于室內(nèi)自然風(fēng)干7 d，待葉片表面枯干后，同種子一起放入95℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)，烘干時間為24 h。待種子和葉片徹底干燥后，取出置于研缽內(nèi)研磨，研磨得越細越好。

1.4硫苷的脫脂

取10個規(guī)格相同的索氏提取器，每5個為一組，用橡皮管串聯(lián)起來。種子與葉片粉末各取5 g，并依次用濾紙包裹起來，分別放在每組的索氏提取器內(nèi)，同時將無水乙醚倒入蒸發(fā)瓶內(nèi)。

取2個數(shù)顯恒溫水浴鍋通電，溫度設(shè)置為60℃，待水浴鍋溫度恒定，將串聯(lián)的索氏提取器分別置于2個水浴鍋內(nèi)。因為乙醚是毒性物質(zhì)，并且揮發(fā)性極強，所以整個脫脂過程需要在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。

脫脂的時間大概為5 h。剛開始脫脂時，虹吸出來的溶液顏色為深綠色，隨著脫脂虹吸次數(shù)的增加，溶液顏色由深綠色漸漸變淺。由于脫脂時間較長，且乙醚的揮發(fā)性極強，所以在脫脂過程中，要及時向蒸發(fā)瓶內(nèi)添加乙醚。當虹吸出來的溶液為無色時，結(jié)束脫脂。按此方法，將種子與葉片粉末各脫脂12次。脫脂結(jié)束后，取出索氏提取器內(nèi)的原料包，并將濾紙打開置于通風(fēng)處，自然揮發(fā)15min即可去除原料中的乙醚。

1.5硫苷的提取

硫苷的提取劑為70%的甲醇溶液。為了確定提取的最佳方法，首先將種子和葉片粉末與70%甲醇溶劑混合，料液比1∶15（g∶mL，下同），在50、60、70、80℃的數(shù)控超聲波清洗器內(nèi)分別振蕩提取，20 min后結(jié)束振蕩，然后上述提取過程重復(fù)1次。最后種子和葉片粉末以料液比1∶15于70℃數(shù)控超聲波清洗器內(nèi)分別提取10、15、20、25 min后結(jié)束震蕩。

種子和葉片原料提取后，在3 000 r/min下離心15 min，結(jié)束后，將上層清液分別盛于小燒杯中。

由于分離后的上層清液中含有大量甲醇，所以采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法去除。將種子與葉片分離后的上層清液分別倒入蒸發(fā)瓶內(nèi)，打開冷凝裝置的進水閥門，并開啟真空泵，同時蒸發(fā)儀的條件設(shè)置為100 r/min，溫度為50℃。當冷凝過程中，甲醇溶液不在滴落，即結(jié)束蒸發(fā)。整個蒸發(fā)過程大概需要150 min，蒸發(fā)后的溶液為深綠色油狀物質(zhì)即硫苷的粗提取物，最后將硫苷的粗提物置于冰箱內(nèi)低溫保鮮。

1.6質(zhì)譜檢測

選取相同條件提取的種子與葉片粗提物，再一次離心分離，并取上層清液進行真空抽濾，再通過質(zhì)譜儀進行檢測，檢測條件為：流動相為乙腈∶水=20∶80；色譜柱：反相C18柱；離子極性：負離子；檢測波長：229nm。

1.7硫苷的純化、濃縮

取粗提物倒入DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠離子交換柱中，當粗提物流盡時，用 40 mL 0.02 mol/L醋酸鈉溶液洗滌，然后用40 mL水沖洗。最后以40 mL 0.5 mol/L硫酸鉀溶液洗脫［16］，收集到的液體通過色譜儀分析純化，要求為：流動相為乙腈∶水=20∶80；檢測波長：229nm；色譜柱：反相C18（4.6mm×150mm）分析柱；流速：1mL/min。找出與質(zhì)譜圖相同的硫苷峰，在反相C18（10 mm×250 mm）制備柱，流速3 mL/min的條件下多次收集該時間段的硫苷峰，將收集到的溶液盛裝在錐形瓶內(nèi)并于冰箱內(nèi)冷凍。

開啟真空冷凍干燥機，將盛裝樣品的錐形瓶置于干機罩內(nèi)，當屏幕顯示-25℃時開啟真空泵。干燥時間大概3～5d，當錐形瓶內(nèi)無液體，出現(xiàn)結(jié)晶時干燥結(jié)束，此結(jié)晶即為樣品濃縮后的硫苷純品。

2　結(jié)果與分析

2.1種子樣品的檢測分析

粗提物的硫苷以鉀鹽的形式存在，在負離子模式下，得到0.7 min時的硫苷碎片峰。如圖1所示，從質(zhì)譜圖中可以發(fā)現(xiàn)種子原料較為純凈，各離子峰的出現(xiàn)較為穩(wěn)定。m/z（質(zhì)荷比）為358.028 48處的離子峰響應(yīng)最高，而此峰與黑芥子苷鉀鹽的［M－K］－相一致，由此可以說明，m/z為358.028 48處的峰即為本試驗需要檢測的硫苷峰。

圖1　種子硫苷的質(zhì)荷比

2.2葉片樣品的檢測分析

在負離子模式下掃描，得到1 min時放大的硫苷離子碎片峰。如圖2所示，從質(zhì)譜圖中可以發(fā)現(xiàn)葉片原料不是很純凈，離子峰的出現(xiàn)較為雜亂。將1min內(nèi)所有的離子峰進行放大處理，發(fā)現(xiàn)了m/z為358.028 48處的峰，而此峰與黑芥子苷鉀鹽的［M－K］－相對應(yīng)，由此可以說明，m/z為358.02848處的峰即為本試驗所需檢測的硫苷峰。但是峰帶在133.014 64、153.023 29、197.80882等時，峰值高，是由于純化效果不是很好，另外，在同等量的料液比中葉片內(nèi)硫苷含量極低。

圖2　葉片硫苷的質(zhì)荷比

2.3HPLC制備后的硫苷分析

取15 μL粗提取的硫苷液進樣，通過反相C18（10 mm×250 mm）制備柱制備后，再由反相 C18（4.6 mm×150 mm）分析柱分析，得到分離、純化后的分析色譜圖。如圖3所示，硫苷峰的響應(yīng)值較高，且峰形較好。分析得到硫苷出峰時間約為1.399 min，說明多次收集此處硫苷峰即可得到分離純化后的硫苷純品。

圖3　純硫苷的HPLC圖譜

2.4提取條件對硫苷量的影響

①料液比如圖4所示，料液比為1∶5～1∶15時，種子硫苷提取量呈勻速上升趨勢，1∶15時硫苷量最高。繼續(xù)增加料液比，硫苷量基本保持不變。料液比為1∶5～1∶15時，葉片硫苷提取量也逐漸上升，料液比為1∶10～1∶15時，硫苷提取量上升最快，當比例為1∶15時，硫苷提取量達到最高，之后隨著比例的增大，硫苷提取量幾乎保持不變。說明，料液比為1∶15為硫苷提取的最佳比例。

②時間如圖5所示，當提取時間不斷增加，硫苷的提取量持續(xù)增大，提取時間達到20min時，硫苷提取量達到最高；繼續(xù)增加提取時間，硫苷提取量幾乎不發(fā)生變化，說明硫苷提取量最佳提取時間為20min。

③溫度如圖6所示，當溫度為60～70℃時，種子和葉片中硫苷提取量隨著溫度的上升而增加，當溫度為70℃時硫苷提取量最大，溫度為70～80℃時硫苷提取量變化不明顯，當溫度高于80℃時，硫苷提取量逐漸降低，這可能是由于溫度過高導(dǎo)致部分硫苷的分解所致。說明，70℃為硫苷提取量的最佳溫度。

3　討論與結(jié)論

本研究首次對莖瘤芥種子和葉片進行硫苷的提取與純化，通過甲醇溶劑的提取后，得到了硫苷的粗提物，其為深綠色油狀物質(zhì)，并伴有特殊刺激性氣味。對硫苷的粗提物進行離心分離、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去甲醇、真空抽濾后采用質(zhì)譜檢測，通過種子和葉子粉末以料液比分別為（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20）（g∶mL）進行等量提取，由圖1、2可知，發(fā)現(xiàn)種子的硫苷離子碎片峰和葉子的離子碎片峰均在1 min內(nèi)出現(xiàn)，種子的峰值高于葉子，說明種子要高于葉子中的硫苷含量。將粗提物通過DEAE SephadexA-25葡聚糖凝膠離子交換柱除雜，經(jīng)高效液相色譜分離純化，找到與質(zhì)譜中相同的硫苷峰，并多次收集1.399min時間段的硫苷物，將收集液冷凍，再通過真空冷凍干燥3～5d，最終得到了晶體物質(zhì)，即為硫苷純品。在多次試驗后，得到并證實了莖瘤芥種子和葉片中硫苷的最佳提取條件：原料與甲醇劑量的比例為1∶15（g∶mL），提取溫度70℃，提取時間20min。而鄧艷美等［17］試驗發(fā)現(xiàn)，原料與提取劑比例為1∶7（g∶mL）、提取時間25 min、提取溫度80℃時，青花菜中硫苷的提取量達到最大，由此說明雖然同屬于十字花科類植物，但物種的不同，導(dǎo)致硫苷的提取條件也不同。因此，在提取不同種類植物內(nèi)硫苷物質(zhì)時，應(yīng)該確定最佳的提取方法。

圖4　硫苷提取量與料液比的關(guān)系

圖5　硫苷提取量與時間的關(guān)系

圖6　硫苷提取量與溫度的關(guān)系

硫苷存在于十字花科植物中，降解后能夠防御害蟲，而當前最為引人注目的就是異硫代氰酸鹽的抗癌作用，因此，研究硫苷的提取與純化有重要的意義。本研究在原料的選取上進行了創(chuàng)新，成功地對莖瘤芥種子和葉子進行提取、純化，下一步將開展莖瘤芥中硫苷酶解研究，為今后試驗提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

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Extraction and Purification of Glucosinolates in Tumorous Stem Mustard Seeds and Leaves

ZHANG Yan，XIU Xinyu
（Life Science and Technology College，Yangtze Normal University，Chongqing，408100）

This paper studied the effects of different material-water ratio（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20），extracted time（10，15，20，25 min）and extracted temperature（50，60，70，80℃）on glucosinolates extraction capacity of tumorous stem mustard seeds and leaves.The results showed that both retention time of seeds and leaves of glucosinolates were less than 1 min，and the content and purity of glucosinolates of seeds was higher than leaves.When the conditions were 1∶15（g∶mL）of material-water ratio，70℃ of temperature and 20 min of time，the extraction of the glucosinolates is of the largest amount.

Tumorous stem mustard；Glucosinolates glycosidase；Extraction；Purification

R284.2

A

1001-3547（2015）18-0045-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2015.18.019

重慶市應(yīng)用開發(fā)計劃項目B類：從榨菜葉中提取異硫代氰酸鹽的技術(shù)研究與應(yīng)用（cstc2013yykfA10003）

張燕（1977-），女，講師，碩士，主要從事細胞與分子生物學(xué)研究，電話：18716890293，E-mail：28789155@qq.com

2015-06-26