王 潔，李 星，王紅揚，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

豬腦乙酰膽堿酯酶的分離純化和性質(zhì)研究

王 潔，李 星，王紅揚，唐云明*

（西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶市甘薯工程研究中心，三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶 400715）

通過離心、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose和Superdex-200層析等步驟，從豬腦中獲得電泳純乙酰膽堿酯酶，該酶比活力和純化倍數(shù)分別為2.05 U/mg和26.97，酶活回收率為11.95%；該酶分子質(zhì)量為257.30 kD，亞基為66.94 kD；以碘化硫代乙酰膽堿為底物時，酶的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適pH值為7.4，且在40 ℃以下，pH 6.0～8.0有較好的穩(wěn)定性；最適底物濃度為4.0 mmol/L，Km為0.94 mmol/L。Ba2+和Zn2+對該酶有強烈的抑制作用，而低濃度Mg2+對該酶有激活作用。

乙酰膽堿酯酶；豬腦；分離純化；性質(zhì)

膽堿酯酶（cholinestease，ChE）是生物體內(nèi)一類重要的水解酶，一般可分為乙酰膽堿酯酶（acetyl cholinesterase，AChE，EC 3.1.1.7）和丁酰膽堿酯酶（butyrycholnesterase，BChE）［1］。乙酰膽堿酯酶是動物神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的遞質(zhì)水解酶，其主要功能是將傳導(dǎo)神經(jīng)興奮的乙酰膽堿迅速水解為乙酸和膽堿，神經(jīng)系統(tǒng)得以進行正常的生理功能［2-3］。

乙酰膽堿酯酶的催化活性可被有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥所抑制。主要是它們能夠快速不可逆地與AChE的活性部位結(jié)合，使其失活，導(dǎo)致昆蟲中毒，起到殺蟲的效果。此外，人畜長期食用含有殘留農(nóng)藥的食物，會使農(nóng)藥殘留在體內(nèi)，并累積致毒害，對人類健康造成不良影響，必須引起高度重視［4］。AChE的活性受抑制程度，即水解產(chǎn)物與農(nóng)藥的量呈線性關(guān)系，利用這一特性形成了針對有機磷和氨基甲酸酯類檢測技術(shù)，用來檢測果蔬中的農(nóng)藥殘留量［5］。由于乙酰膽堿酯酶在神經(jīng)傳導(dǎo)中的重要作用以及它與有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥中毒作用的密切關(guān)系，引起了人們極大的關(guān)注。1938年，Nachmansohn和Lederer從電鰩（Torpedo mamorata）的電器官分離了AChE［6］，此后不同來源的乙酰膽堿酯酶相繼得到了純化和研究。如海參腸［7］、騷擾角蠅［8］、中國丁氏雙鰭電鰩［9］、鲅魚腦［3］、黃姑魚肌肉［10］、眼睛蛇毒液［11］、鴨血清［12］和胎牛血清［13］等。乙酰膽堿酯酶作為生物標志物，在農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)境、軍事、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中有重要用途［14］。我國是世界上第一養(yǎng)豬大國，養(yǎng)豬量約占全世界的一半。從豬腦中分離純化乙酰膽堿酯酶，這對于提高養(yǎng)豬收益，同時豐富乙酰膽堿酯酶研究內(nèi)容具有重要的實踐和理論意義。因此，本實驗從豬腦中分離純化乙酰膽堿酯酶并研究其酶學(xué)性質(zhì)，以期為該酶的來源及進一步研究和豬腦的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

新鮮豬腦購于重慶市天生農(nóng)貿(mào)市場，于-20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

牛血清白蛋白、碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide，ATCh）、碘化硫代丁酰膽堿（S-butyrylthiocholine iodide，BTCh）、二硫代雙硝基苯甲酸（5，5’-dithio bis-（2-nitrobenzoic acid），DTNB）、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 美國Fluka公司；DEAE-Sepharose、Superdex-200、凝膠層析分子質(zhì)量標準品、蛋白質(zhì)SDSPAGE標準品 美國GE公司；三羥甲基氨基甲烷 香港Farco公司；Triton X-100、考馬斯亮藍R-250 美國Bio-Rad公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

UV-2550型分光光度計、核酸蛋白分析儀 日本島津公司；AKTA Prime plus純化系統(tǒng) 美國GE公司；5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；AL204精密電子天平、Seven Easy pH計 瑞士Mettler-Toledo公司；Mill-Q plus純水儀 美國Millipore公司；垂直電泳槽和電泳儀 美國Bio-Rad公司；MC4L冷凍干燥機德國Uni-Equip公司。

1.2方法

1.2.1粗酶液的制備

新鮮豬腦稱質(zhì)量后，用自來水洗凈，除去腦膜和大血管，再用蒸餾水反復(fù)沖洗數(shù)次，剪碎，然后以1：3（m/V）的比例加入預(yù)冷的0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液（含1% Triton X-100，15 mmol/L NaCl），勻漿后于4 ℃冰箱靜置抽提2 h。在4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，收集上清液，并且緩慢滴入0.1 mo/L硫酸溶液調(diào)整pH值至5.5［15-16］，4 ℃條件下靜置3 h后，8 000 r/min離心30 min，收集上清液加入硫酸銨至30%飽和度，4 ℃條件下靜置2 h后，8 000 r/min離心30 min，收集上清液加入硫酸銨至飽和度為50%，4 ℃鹽析2 h，8 000 r/min離心30 min，沉淀用0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液溶解，4 ℃條件下透析過夜即得粗酶液。

1.2.2DEAE-Sepharose層析

DEAE-Sepharose層析柱用0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液平衡后，取透析后的酶液10 mL上樣，用0～0.5 mol/L NaCl（0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液配制）進行線性梯度洗脫，流速0.5 mL/min，測定各管酶活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液，4 ℃透析過夜，冷凍干燥后進行凝膠層析。

1.2.3Superdex-200層析

Superdex-200層析柱（16 mm×835 mm）經(jīng)0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液平衡后，取經(jīng)DEAE-Sepharose層析收集濃縮后的酶液5 mL上樣，用Tris-HCl（0.02 mol/L pH 7.4）緩沖液洗脫，流速為0.3 mL/min，測定每管酶活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的酶液，4 ℃透析除鹽，冷凍干燥后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4乙酰膽堿酯酶活性的測定

參照Ellman等［17］的方法進行，具體操作為：在試管中加入3 mL 0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液（pH 7.4），加入20 μL乙酰膽堿酯酶酶液，混勻，在30 ℃恒溫水浴保溫10 min，然后依次加入100 μL 10 mmol/L DTNB溶液，20 μL 75 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿溶液，總體積為3.14 mL，充分混勻，在412 nm波長處進行比色，每隔0.5 min讀數(shù)一次，連續(xù)測定3 min，根據(jù)1 min內(nèi)OD412nm值變化來計算酶活力。每分鐘催化分解1 μmol碘化硫代乙酰膽堿所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.5蛋白質(zhì)含量的測定

采用Bradford方法［18］和紫外分光光度法［19］。

1.2.6乙酰膽堿酯酶純度的鑒定及分子質(zhì)量測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）進行純度鑒定［20］，5%濃縮膠，10%分離膠。全分子質(zhì)量測定采用凝膠過濾法［21］，酶亞基分子質(zhì)量的確定采用SDS-PAGE法測定［22］。

1.2.7乙酰膽堿酯酶性質(zhì)的測定

1.2.7.1溫度和pH值對乙酰膽堿酯酶活性的影響

分別在20、30、37、40、50、60、70 ℃，以及pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下，測定乙酰膽堿酯酶的活性，以確定溫度和pH值對AChE活性的影響。

1.2.7.2底物對乙酰膽堿酯酶活力的影響

分別將碘化硫代乙酰膽堿和碘化硫代丁酰膽堿配制成0.5～10.0 mmol/L的底物溶液，測定其相應(yīng)的酶活力，以確定底物對酶活性的影響。

1.2.7.3乙酰膽堿酯酶米氏常數(shù)的測定

將碘化硫代乙酰膽堿配制成不同濃度（0.5～4.0 mmol/L）的溶液，按酶活力測定方法測定相應(yīng)的酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法［23］，求出Km值。

1.2.7.4部分金屬離子對乙酰膽堿酯酶活力的影響

用0.02 mol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖液將不同的金屬離子溶液稀釋成1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mmol/L的溶液。取上述溶液3 mL添加到酶反應(yīng)體系中，按酶活力測定方法測定相應(yīng)的酶活力，以確定某些金屬離子對該酶的影響。

2　結(jié)果與分析

2.1豬腦乙酰膽堿酯酶的分離純化

豬腦乙酰膽堿酯酶粗提液經(jīng)DEAE-Sepharose層析（每管收集5 mL）的洗脫圖譜如圖1所示。乙酰膽堿酯酶的活性峰出現(xiàn)在41～47 管之間，其中44 管酶活性最高。經(jīng)透析、冷凍濃縮后，再經(jīng)Superdex-200層析（每管收集3 mL）的洗脫圖譜見圖2，乙酰膽堿酯酶活性峰23～28 管，其中26 管酶活性最高。收集活性管酶液經(jīng)透析冷凍干燥濃縮后備用。酶的整個分離純化結(jié)果見表1，該酶的比活力較低，還需優(yōu)化實驗條件進一步提高純化倍數(shù)。

圖1　豬腦乙酰膽堿酯酶DEAE-Sepharose層析洗脫圖譜Fig.1 DEAE-Sepharose chromatographic profile of AChE from porcine brain

圖2　豬腦乙酰膽堿酯酶Superdex-200層析圖譜Fig.2 Superdex-200 chromatographic profile of AChE from porcine brain

表1　豬腦乙酰膽堿酯酶的純化結(jié)果Table1 Purification of AChE from porcine brain

2.2豬腦乙酰膽堿酯酶的分子質(zhì)量

所得的豬腦乙酰膽堿酯酶經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶，見圖3，說明該酶已達到電泳純。測定其亞基分子質(zhì)量為66.94 kD，經(jīng)Superdex-200層析法測定豬腦AChE的全酶分子質(zhì)量為257.30 kD，因此，推測豬腦AChE由4 個相同的亞基組成。

圖3　豬腦乙酰膽堿酯酶SDS-PAGGEE圖Fig.3 SDS-PAGE of purified AChE from porcine brain

2.3豬腦乙酰膽堿酯酶的性質(zhì)

2.3.1豬腦乙酰膽堿酯酶的最適溫度與熱穩(wěn)定性

圖4　溫度對豬腦乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity of AChE from porcine brain

圖5　豬腦乙酰膽堿酯酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Effects of temperature on the stability of AChE from porcine brain

在20～70 ℃條件下，分別測定AChE的活性，其他條件不變。以酶活力最高值為100%，結(jié)果見圖4。AChE的最適反應(yīng)溫度在37 ℃。酶液在20～60 ℃條件下分別保溫0.5、1.0、2.0、3.0 h后，測定酶活力，以酶液不保溫時的酶活力為100%，結(jié)果如圖5所示，在20～40 ℃內(nèi)，酶活性較穩(wěn)定。保溫0.5 h活性保留原有活性的50%以上。50 ℃保溫1.0 h，酶活力損失90%以上，60 ℃保溫0.5 h，酶失活。隨著溫度的升高，酶活力迅速降低，溫度為70 ℃時，酶完全失活。說明該酶在低于40 ℃條件下，具有一定的穩(wěn)定性。

2.3.2豬腦乙酰膽堿酯酶的最適pH值及穩(wěn)定性

圖6　pH值對豬腦乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.6 Effect of pH on the activity of AChE from porcine brain

圖7　豬腦乙酰膽堿酯酶的pH值穩(wěn)定性Fig.7 pH-dependent stability of AChE from porcine brain

在pH 4.0～9.0的緩沖液中測定AChE的活性，以酶活力最高值為100%，如圖6所示。酶的最適pH值為7.4。在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)AChE的活力均可達到最高酶活力的70%以上，pH值低于7.0或高于8.0酶活力均下降。將純化的酶液與pH 4.0～9.0的緩沖液相混合，室溫條件下，分別放置1.0、2.0、3.0、4.0 h，測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計算pH 4.0～9.0條件下的相對酶活力，結(jié)果見圖7，表明當pH 7.0～8.0范圍內(nèi)，放置時間2.0 h，酶活力保持在80%以上。當pH值為4.0時，酶完全失活。pH 9.0時，2.0 h后酶活力完全喪失，當pH 5.0、4.0 h后，酶活力僅剩40%。

2.3.3底物對豬腦乙酰膽堿酯酶活力的影響

圖8　底物對豬腦乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.8 Effects of concentrations of the substrates ATCh and BTCh on the activity of AChE from porcine brain

在最適反應(yīng)條件下，分別以0.5～10.0 mmol/L碘化硫代乙酰膽堿和0.5～10.0 mmol/L碘化硫代丁酰膽堿為底物，測定豬腦AChE的酶活力，以最高酶活力為100%作圖，結(jié)果如圖8所示。發(fā)現(xiàn)當以碘化硫代丁酰膽堿為底物時，酶活力很難檢測，幾乎沒有酶活力，以碘化硫代乙酰膽堿為底物時，底物濃度較低時，酶活力隨著濃度的增加而增大，當濃度超過4.0 mmol/L時，酶活力隨著底物濃度的增加而降低，說明豬腦AChE最佳底物為碘化硫代乙酰膽堿，以碘化硫代乙酰膽堿為底物時，表現(xiàn)底物過量抑制現(xiàn)象。

2.3.4豬腦乙酰膽堿酯酶的米氏常數(shù)

用不同濃度（0.5～4.0 mmol/L）的碘化硫代乙酰膽堿溶液，在pH 7.4、37 ℃條件下測定豬腦AChE的酶活力，采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk），得圖9，求得豬腦AChE對碘化硫代乙酰膽堿的Km為0.94 mmol/L。

圖9　雙倒數(shù)法測得豬腦乙酰膽堿酯酶的米氏常數(shù)Fig.9 Lineweaver-Burk plot for Kmdetermination of AChE from porcine brain

2.3.5不同金屬離子對豬腦乙酰膽堿酯酶活力的影響

圖10　金屬離子對豬腦乙酰膽堿酯酶活力的影響Fig.10 Effects of various metal ions on the activity of AChE from porcine brain

不同濃度（1.0～10.0 mmol/L）的金屬離子溶液添加到酶反應(yīng)體系中，以0 mmol/L的酶活力作為100%，計算其他濃度的相對酶活力，結(jié)果如圖10所示，低濃度的Mg2+溶液對該酶具有激活作用，超過一定濃度后，隨著溶液濃度的增加，出現(xiàn)抑制作用，其他金屬離子對該酶表現(xiàn)出不同的抑制作用，尤其Ba2+和Zn2+的抑制作用最為明顯；K+和Li+對酶的抑制作用隨濃度的升高而有所下降。

3　討 論

本研究以來源廣泛、廉價的豬腦為分離純化材料；通過勻漿離心、硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose層析和Superdex-200層析等方法，從豬腦中獲得了回收率為11.95%、純化倍數(shù)26.97 倍、酶比活力為2.05 U/mg的乙酰膽堿酯酶，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳可得單一條帶，說明該酶達到了電泳純。許多膽堿酯酶是存在于膜上的酶［10］，用表面活性劑將膜上的膽堿酯酶溶解下來是一種溫和有效的方法。Triton X-100是一種非離子表面活性劑，蛋白質(zhì)的疏水區(qū)及膜脂與之形成共膠束，從而提高Triton X-100與膜的親和性，使AChE從膜上脫落。因此本實驗提取液中添加體積分數(shù)為1%的Triton X-100，使酶從膜上分離下來。

從豬腦中分離純化得到的乙酰膽堿酯酶，經(jīng)Superdex-200層析測得全酶分子質(zhì)量為257.30 kD，經(jīng)SDS-PAGE測定亞基分子質(zhì)量為66.94 kD，則該酶由4 個相同亞基組成；該酶催化碘化硫代乙酰膽堿最適溫度為37 ℃，最適pH值為7.4，溫度在40 ℃以下，該酶有較好熱穩(wěn)定性，在pH 6.0～8.0范圍內(nèi)，該酶相對穩(wěn)定。不同來源的乙酰膽堿酯酶的最適溫度和最適pH值略有差別，如來源于蚯蚓的AChE最適溫度為39 ℃［24］；來源于黃魚腦組織的AChE最適溫度是35 ℃，最適pH值是8.0［25］；來源于鲅魚腦組織AChE最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.5［3］。

豬腦乙酰膽堿酯酶的Km值為0.94 mmol/L，與其他不同生物來源的乙酰膽堿酯酶Km值相比較，高于家蠶頭部來源的乙酰膽堿酯酶Km0.392 mmol/L［26］和來源于羅非魚肌肉AChE的表觀Km0.229 mmol/L［27］；低于來源于胎牛血清的乙酰膽堿酯酶Km7.48 mmol/L［13］，與無脊椎動物真寬水蚤乙酰膽堿酯酶Km0.02 mmol/L［28］存在明顯的差異。底物過量抑制是區(qū)別乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的一個重要依據(jù)［29］，豬腦乙酰膽堿酯酶的最佳底物是碘化硫代乙酰膽堿，當?shù)孜餄舛瘸^4.0 mmol/L時，表現(xiàn)出過量底物抑制現(xiàn)象，并且該酶不能催化分解碘化硫代丁酰膽堿。Ba2+和Zn2+對豬腦乙酰膽堿酯酶有顯著的抑制作用；低濃度的Mg2+對AChE具有激活作用，高濃度時則抑制其活性，Mg2+的加入，可能會降低酶催化反應(yīng)的活化能，以加快酶促反應(yīng)的速率［30］。

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Purification and Characterization of Acetylcholinesterase from Porcine Brain

WANG Jie， LI Xing， WANG Hongyang， TANG Yunming*
（Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region， Ministry of Education， Chongqing Sweet-potato Engineering Research Center， College of Life Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Acetylcholinesterase （AChE） was purified from porcine brain by consecutive steps including centrifugation，ammonium sulfate fractionation， DEAE-Sepharose chromatography and Superdex-200 gel filtration chromatography. The purified AChE exhibited a specific activity of 2.05 U/mg， with 26.97-fold purification and an activity yield of 11.95%. The relative molecular weight of AChE was 257.30 kD， and the subunit molecular weight was 66.94 kD. The optimal pH and temperature for the enzyme were 7.4 and 37 ℃， respectively. The enzyme was stable below 40 ℃ and in the pH range of 6.0-8.0. At an optimal substrate concentration of 4.0 mmol/L， the apparent Kmwas 0.94 mmol/L. The activity of AChE was inhibited by Ba2+or Zn2+， but enhanced by Mg2+.

acetylcholinesterase； porcine brain； isolation and purification； characterization

Q946.5

A

1002-6630（2015）03-0137-05

10.7506/spkx1002-6630-201503026

2014-03-01

重慶市科委重點攻關(guān)項目（CSTC2011AB1027）

王潔（1985—），女，碩士研究生，主要從事生化遺傳學(xué)研究。E-mail：wangjie51031@163.com

唐云明（1960—），男，教授，博士，主要從事蛋白質(zhì)與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn