王 晶

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧　錦州　121000）

秦皮甲素通過(guò)抑制Ras/ERK通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡

王 晶

（遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧錦州121000）

目的 探討秦皮甲素通過(guò)抑制Ras/ERK通路誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡的作用。方法 MTT法檢測(cè)肺癌細(xì)胞A549的增殖，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分光光度法檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性，免疫印跡法檢測(cè)K-Ras、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果秦皮甲素可抑制人肺癌細(xì)胞A549的增殖，IC50值為0.4 mmo1/L，并誘導(dǎo)凋亡；caspase3和caspase9表達(dá)增強(qiáng)，caspase8表達(dá)無(wú)明顯改變。p-ERK1/2和K-Ras蛋白表達(dá)減弱，而ERK1/2蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論 秦皮甲素通過(guò)顯著抑制K-Ras的表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞A549凋亡。

秦皮甲素；人肺癌細(xì)胞A549；Ras/ERK通路；凋亡

秦皮始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，秦皮甲素是中藥秦皮中發(fā)揮藥理作用的主要有效成分［1］，現(xiàn)在中藥有效成分的臨床應(yīng)用已經(jīng)成為中醫(yī)藥發(fā)展的重要內(nèi)容。秦皮藥材資源豐富，價(jià)格低廉，秦皮甲素是中藥秦皮中含有量最高的成分（1.436%～3.043%）。前期的研究顯示，秦皮甲素可以誘導(dǎo)人肺癌細(xì)胞H-125的凋亡［2］，但是對(duì)其具體作用機(jī)制并未進(jìn)行深入探討；而且秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的作用并未進(jìn)行研究。因此本實(shí)驗(yàn)擬研究秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖、凋亡的作用并對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行深入探討，為秦皮甲素的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞A549購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)。

1.2藥物 秦皮甲素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110740-200104）。兔抗人K-Ras、ERK1/ 2、p-ERK1/2一抗（Ce11Signa1ing公司），鼠抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)公司）。

1.3試劑 MTT（Sigma公司）；Annexin-PI凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽生物有限公司）；caspase-3，caspase-8，caspase-9活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；胰蛋白酶（Hyc1one公司）；小牛血清（杭州四季清生物制品公司）；RPML-1640培養(yǎng)基（南京凱基公司）。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4儀器 熒光顯微鏡（LEICACTR4000，德國(guó)），XD-101型倒置顯微鏡（OLYMPUS TOKYO JAPAN）；流式細(xì)胞儀（BD FACSCaLibur）；凝膠成像儀（美國(guó)BIORAD）；超凈工作臺(tái)（江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所）；二氧化碳培養(yǎng)箱（She1don Manufacturing IncUSA）；酶標(biāo)儀（9602A北京普朗）。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞A549用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每?jī)商鞊Q液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肺癌細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)，以5× 103～10×103個(gè)/孔接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu 0.77 mmo1/L）、秦皮甲素處理組（秦皮甲素0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmo1/L），每孔200 μL。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后終止反應(yīng)，每孔加入MTT 20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用翻板法將上清棄去，每孔加入DMSO 150μL，在搖床上振動(dòng)混勻10 min。在酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A）值。抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照孔A值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均抑制率。

2.3Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取人肺癌細(xì)胞A549按4×104個(gè)/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu 0.77 mmo1/L）、秦皮甲素處理組（秦皮甲素0.4、0.8、1.6 mmo1/L）。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，取出細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，5 mL PBS洗細(xì)胞兩次，800×g離心5 min，收集細(xì)胞至檢測(cè)管內(nèi)。采用Annexin V-FITC染色，加入10μL AnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定。數(shù)據(jù)經(jīng)Bioconsort專用軟件處理，分析細(xì)胞凋亡率。

2.4分光光度法檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性 細(xì)胞分組、處理同“2.3”項(xiàng)。然后按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。600×g 4℃離心5 min，收集細(xì)胞，小心吸除上清，PBS洗滌1次。每個(gè)樣品均加入裂解液150μL，重懸沉淀，冰浴裂解細(xì)胞15 min，然后16 000×g 4℃離心15 min，將上清小心轉(zhuǎn)移至冰浴預(yù)冷的空白EP管中。96孔板中每孔依次加入檢測(cè)緩沖液60μL，待測(cè)樣品30 μL，底物Ac-IETD-ρNA 10μL，小心混勻。37℃避光孵育6 h，405 nm處測(cè)定樣品吸光值，樣品吸光值減去對(duì)照組吸光值即為樣品中caspase催化產(chǎn)生ρNA的吸光度值。再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，即可反映caspase酶活性的大小。結(jié)果用試驗(yàn)組A405值/對(duì)照組A405值的比值來(lái)表示。

2.5免疫印跡法檢測(cè)ERK1/2，p-ERK，K-Ras蛋白表達(dá)的變化 細(xì)胞分組、處理同“2.3”項(xiàng)。然后一步法裂解細(xì)胞，在4℃時(shí)12 500 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。用10%SDSPAGE分離蛋白，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。加入1∶1 000稀釋一抗，4℃過(guò)夜，洗膜。再加入1∶1 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，洗膜4次，每次15 min。最后顯色，照相。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞增殖的影響 秦皮甲素作用于人肺癌A549細(xì)胞48 h后，顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖。并且隨著秦皮甲素濃度的升高，抑制率也明顯增大。秦皮甲素的IC50值為0.4 mmo1/L。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖的影響（±s，n=5）Tab.1 Effects of escu Iin on the proIiferation of A549 human Iung cancer（±s，n=5）

表1　秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549增殖的影響（±s，n=5）Tab.1 Effects of escu Iin on the proIiferation of A549 human Iung cancer（±s，n=5）

注：與陰性對(duì)照組比較，★★P＜0.01

組 別檢測(cè)濃度/（mmo1·L-1）吸光度值抑制率/ % 0 0.872±0.19 0陽(yáng)性對(duì)照組（5-Fu）0.77 0.312±0.13★★64.2秦皮甲素組0.1 0.559±0.20★★35.9秦皮甲素組0.2 0.470±0.17★★46.1秦皮甲素組0.4 0.436±0.25★★50秦皮甲素組0.8 0.301±0.23★★65.4秦皮甲素組1.6 0.246±0.15★★陰性對(duì)照組71.8

3.2秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞凋亡的影響 應(yīng)用Annexin V-FITC和PI雙染法檢測(cè)凋亡，Annexin V可與凋亡早期翻轉(zhuǎn)到膜外的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合。PI能夠透過(guò)凋亡中、晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此Annexin V與PI合用，可以將凋亡早期和晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。秦皮甲素作用于人肺癌A549細(xì)胞48 h后，隨著秦皮甲素濃度的升高，凋亡現(xiàn)象明顯，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549凋亡的影響Fig.1　Effects of escu Iin on apop tosis in human Iung cancer A549

3.3秦皮甲素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞caspase3、8、9表達(dá)的影響 由表2可見(jiàn)，秦皮甲素作用于人肺癌A549細(xì)胞后，caspase3和caspase9的表達(dá)隨秦皮甲素濃度的升高而增強(qiáng)，caspase8的表達(dá)無(wú)明顯改變。

表2　秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549caspase3、8、9表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.2 Effects of escu Iin on caspase3，8，9 activity in human Iung cancer A549（±s，n=5）

表2　秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞A549caspase3、8、9表達(dá)的影響（±s，n=5）Tab.2 Effects of escu Iin on caspase3，8，9 activity in human Iung cancer A549（±s，n=5）

注：與陰性對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

1.0 1.0 1.0 5-Fu 0.77 mmo1/L 1.37±0.25*1.58±0.08*1.03±0.22*秦皮甲素0.4 mmo1/L 1.16±0.09*1.24±0.14*0.99±0.10*秦皮甲素0.8 mmo1/L 1.34±0.12*1.63±0.21*1.08±0.05*秦皮甲素1.6 mmo1/L 1.79±0.30**2.05±0.18*1.05±0.20 caspase3 caspase9 caspase8陰性對(duì)照組組 別*

3.4秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞ERK1/2，p-ERK1/2，K-Ras蛋白表達(dá)的影響 秦皮甲素作用于人肺癌A549細(xì)胞48 h后，K-Ras蛋白的表達(dá)減弱，ERK1/2蛋白的表達(dá)無(wú)明顯改變，p-ERK1/2蛋白的表達(dá)明顯降低，見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，秦皮甲素可以顯著抑制K-Ras的表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平。

4　討論

秦皮甲素是中藥秦皮中的主要有效成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原微生物、抗病毒、抗氧化等作用。近幾年研究發(fā)現(xiàn)秦皮甲素在體內(nèi)外均顯示抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用?？梢种苹瘜W(xué)致癌物1，2-二甲肼誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸DNA氧化損傷和腫瘤生長(zhǎng)［1］。

細(xì)胞凋亡又稱為程序性細(xì)胞死亡，目前已知兩種信號(hào)途徑可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，即外源性途徑作用于半胱氨酸蛋白酶caspase8；內(nèi)源性途徑作用于半胱氨酸蛋白酶caspase9，二者最終都活化下游caspase3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［3-8］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著秦皮甲素濃度升高，細(xì)胞凋亡率增大的同時(shí)可使半胱氨酸蛋白酶caspase9、caspase3活性增強(qiáng)，而對(duì)caspase8的活性沒(méi)有影響。由此可見(jiàn)，秦皮甲素可以通過(guò)內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因?yàn)樵诩?xì)胞凋亡過(guò)程中ERK通路發(fā)揮著重要的作用，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了秦皮甲素是否參與了ERK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。

圖2　秦皮甲素對(duì)人肺癌細(xì)胞ERK1/2，p-ERK 1/2，K-Ras蛋白表達(dá)的影響Fig.2　Effects of escu Iin on expressions of protein ERK 1/2，p-ERK1/2，K-Ras in human Iung cancer ceIIA549

Ras/Raf/MEK/ERK是ERK通路的主要途徑，K-Ras蛋白是人類腫瘤中最常見(jiàn)的突變類型，ERK1/2是其下游信號(hào)分子。ERK1/2是決定細(xì)胞命運(yùn)的關(guān)鍵分子，決定著細(xì)胞的分裂增殖、終末分化或進(jìn)入凋亡程序。ERK1/2激活后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，可激活或滅活其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵效應(yīng)分子，調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達(dá)或活性改變，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖和惡性轉(zhuǎn)化，阻止細(xì)胞凋亡，同時(shí)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞免疫印跡試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，秦皮甲素作用于人肺癌A549細(xì)胞48 h后，可顯著抑制KRas的表達(dá)和ERK1/2的磷酸化水平。結(jié)果顯示秦皮甲素可通過(guò)抑制K-Ras及其下游信號(hào)分子的活化而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ERK信號(hào)通路作為一條將細(xì)胞外信息向細(xì)胞核傳遞的通路，在細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程中都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［12-13］，因此有可能成為治療肺癌的新靶點(diǎn)。

綜上所述，秦皮甲素可以抑制人肺癌細(xì)胞A549的增殖，并通過(guò)內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)凋亡。但是，秦皮甲素在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中還有哪些信號(hào)分子參與其中，是否影響腫瘤血管的形成等等，這些作用機(jī)制尚需進(jìn)行深入研究。

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Escu Iin induces A549 Iung cancer ceIIapoptosis by inhibiting Ras/ERK pathway

WANG Jing
（First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University，Jinzhou 121000，China）

AIM To exp1ore the escu1in's possib1e effect of inducing apoptosis of A549 1ung cancer ce11 through inhibiting the Ras/ERK pathway.METHODS A549 1ung cancer ce11pro1iferation wasmeasured by MTT method，ce11apoptosiswas detected by f1ow cytometry，the activities of cysteine protease caspase-3，8，9 were determined by spectrophotometric method.The protein expression changes of K-Ras，extrace11u1ar signa1 regu1ating kinase1/2（ERK1/2），phosphory1ated ERK1/2（p-ERK1/2）were determined by Western-b1ot.RESULTS Escu1in inhibited the pro1iferation of human A549 1ung cancer ce11s and induced its apoptosis with a IC50of 0.4 mmo1/L，and the activities of caspase-3，caspase-9 increased whi1e caspase-8 did not show any significant change. Protein expression of p-ERK and K-Ras decreased and ERK1/2 remained the same.CONCLUSION The data demonstrats that escu1in-induced apoptosis in A549 1ung cancer ce11 is performed by inhibiting the Ras protein expression and ERK phosphory1ation.

escu1in；A549 1ung cancer ce11；Ras/ERK pathway；apoptosis

R966

A

1001-1528（2015）01-0040-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.01.007

2014-02-15

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013022063）

王 晶（1974—），女，主管藥師，研究方向：中藥抗腫瘤藥理。Te1：15004162307，E-mai1：wangjing2006050@126.com