孫永健等

摘要：探討了水、赤霉素GA3對杜仲完整種子與剝離胚乳產(chǎn)生的愈傷組織的作用，設(shè)置了不同激素種類及濃度配比的培養(yǎng)基并在培養(yǎng)基中添加了酵母提取物與水解酪蛋白，研究了激素、外源有機(jī)添加物對胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)與改造的作用。結(jié)果表明，最佳的前處理方式為：800 mg/L的赤霉素浸泡完整種子24 h；最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+瓊脂6.3 g/L+蔗糖30 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；對愈傷組織繼代與改造有較好促進(jìn)作用的外源有機(jī)添加物為：酵母提取物。

關(guān)鍵詞：杜仲；胚乳培養(yǎng)；三倍體愈傷組織；赤霉素

中圖分類號： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0090-03

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）別稱思仙，主產(chǎn)于河南、四川、江蘇等地，為杜仲科杜仲屬植物，且杜仲科僅1屬1種，為我國特有的一種名貴藥用植物，資源稀少，具有補(bǔ)腎壯腰、抑制腫瘤生長、雙向調(diào)節(jié)血壓等作用[1-3]；它也是溫帶最具開發(fā)利用前景的膠源植物，在它的葉片、樹皮、根皮和果皮中都含有杜仲膠，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很高[4-6]。杜仲為二倍體（2n=2x=34）落葉喬木，以種子繁殖為主，以收獲樹皮、樹葉等營養(yǎng)體為主要栽培目的。杜仲種子中的胚乳是雙受精的產(chǎn)物，因此是三倍體，鑒于多倍體植物具有器官巨大、抗逆性強(qiáng)和生化物質(zhì)含量高等特點(diǎn)，結(jié)合杜仲的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，多倍體育種應(yīng)成為杜仲遺傳改良的主要途徑之一[7-9]。因此，通過組織培養(yǎng)的方法，誘導(dǎo)杜仲胚乳產(chǎn)生三倍體愈傷組織，可以為后續(xù)再分化獲得三倍體植株提供物質(zhì)基礎(chǔ)，而且利用三倍體植株細(xì)胞體積增大的特點(diǎn)可以提高杜仲單株產(chǎn)膠量或細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物含量[10-14]。

1材料與方法

1.1供試材料

杜仲成熟種子采自天津農(nóng)學(xué)院。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1材料的前處理將新采收的成熟飽滿的杜仲翅果晾干，剝?nèi)ス?，取出種子，洗凈。做以下5種處理：A：將種子沿背腹線切成兩半，剔除其中種胚，留胚乳備用；B：按上述方法取得胚乳，用無菌水浸泡24 h；C：按上述方法取得胚乳，置于GA3中浸泡24 h（設(shè)置GA3的濃度分別為C1處理：400 mg/L、C2處理：600 mg/L、C3處理：800 mg/L、C4處理：1 000 mg/L）；D： 將完整的種子置于無菌水中浸泡24 h；E：將完整的種子置于GA3中浸泡24 h（設(shè)置GA3的濃度分別為E1處理：400 mg/L、E2處理：600 mg/L、E3處理：800 mg/L、E4處理：1 000 mg/L）。將處理好的材料，用70%乙醇浸泡15 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%Hgcl2處理6 min，無菌水沖洗5次后備用。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)將滅菌后的胚乳置于無菌的培養(yǎng)皿中，在超凈臺中切除每扇胚乳子葉端的3/4，將占種子全長1/4的胚根端胚乳接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中；滅好菌的完整種子，先在無菌的環(huán)境下剝離種胚，取得胚乳，再按上述方法切割后接種。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基見表1。

1.2.3愈傷組織的繼代與改造將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織切下，接種到繼代培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)基配方見表2。

表2愈傷組織繼代培養(yǎng)基

處理酵母提取物

（mg/L）水解酪蛋白

（mg/L）G100G28000G30800注：培養(yǎng)基為MS+ZT 0.8 mg/L + NAA 0.8 mg/L +瓊脂6.3 g/L+蔗糖30 g/L。

2結(jié)果與分析

2.1取材部位與前處理方法對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

經(jīng)不同方式處理后的材料接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基2周后，大部分胚乳開始膨大（圖1）。為避免褐化現(xiàn)象加重，將膨大的部分切下，繼續(xù)接種于相同成分的培養(yǎng)基中，再經(jīng)35 d左右的培養(yǎng)，部分膨大的胚乳會形成疏松白色的愈傷組織（圖2）。統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，水和GA3的浸泡對于胚乳脫分化形成愈傷組織具有促進(jìn)作用，且GA3的促進(jìn)作用優(yōu)于水，愈傷組織誘導(dǎo)率最高可達(dá)20.2%；GA3的促進(jìn)作用會隨著濃度的增大而增大，濃度為800 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)效果最好，當(dāng)濃度達(dá)到1 000 mg/L時(shí)GA3的促進(jìn)作用又開始下降（表3、圖3）；完整種子中的胚乳相對于剝離出來的胚乳，脫分化形成愈傷組織的能力更強(qiáng)（表3）。

2.2培養(yǎng)基對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

研究發(fā)現(xiàn)，在不添加激素的培養(yǎng)基中，胚乳雖然可以膨

大，但是不能形成愈傷組織。因此，向培養(yǎng)基中添加了3種不同濃度配比的激素。統(tǒng)計(jì)愈傷組織形成的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，NAA在一定濃度范圍內(nèi)，具有促進(jìn)杜仲胚乳形成愈傷組織的作用；雖然2，4-D在很多植物中具有促進(jìn)愈傷組織形成的作用，但是在杜仲胚乳形成愈傷組織的過程中，2，4-D起了抑制作用，且這種抑制作用會隨著培養(yǎng)基中其他激素濃度的增大而增大；誘導(dǎo)杜仲胚乳產(chǎn)生愈傷組織的最佳激素種類及濃度配比為：6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，誘導(dǎo)率最高可達(dá)114%（表4）。

2.3外源添加物對愈傷組織生長的作用

經(jīng)誘導(dǎo)后初生的疏松白色的愈傷組織生長慢且不具備分化能力，需將其轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在繼代1～2次之后，部分會轉(zhuǎn)變成綠色且質(zhì)地緊密、具有分化能力的愈傷組織（圖4、圖5），未轉(zhuǎn)變的愈傷組織繼續(xù)在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代，會逐步轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)，激素種類及濃度配比為ZT 0.8 mg/L + NAA 0.8 mg/L時(shí)，對愈傷組織的繼代與改造效果最佳；適當(dāng)添加外源有機(jī)物對愈傷組織的改造具有促進(jìn)作用，其中酵母提取物（YE）的促進(jìn)效果最佳，愈傷組織改造率可達(dá)41.5%，新生的愈傷組織顏色綠且質(zhì)地緊密，經(jīng)2周繼代培養(yǎng)后，增殖效果也較好（表5、圖4）。

3討論

Srivastava[8]在羅氏核實(shí)木胚乳培養(yǎng)研究中指出，利用成熟胚乳培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，必須有原位胚的參與或用GA3進(jìn)行處理。本研究支持了Srivastava這一觀點(diǎn)，水的浸泡對完整種子中的胚乳誘導(dǎo)愈傷組織有促進(jìn)作用而對剝離的胚乳沒有作用，說明了完整種子經(jīng)水浸泡后休眠被打破，種子中的胚被活化，從而影響胚乳的誘導(dǎo)。而GA3具有打破種子休眠、促進(jìn)發(fā)芽的作用，因此會對胚乳產(chǎn)生類似種胚在萌發(fā)過程中對其產(chǎn)生的影響， 從而促進(jìn)了胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)。但GA3表5不同外源添加物對愈傷組織生長的作用

處理接種愈傷組織數(shù)

（個(gè)）愈傷組織變化數(shù)

（個(gè)）改造率

（%）愈傷組織質(zhì)地愈傷組織顏色繼代2周后愈傷

組織大小G11382618.8稍疏松淺綠色較大G21476141.5緊密綠色較大G31334332.3較緊密淺綠色大

為植物生長調(diào)節(jié)劑，須在一定濃度范圍內(nèi)使用，濃度過高，反而會對胚乳誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生抑制作用。

2，4-D作為植物生長調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)植物組織的膨大，但它對胚乳愈傷組織誘導(dǎo)的抑制作用可能是由于其可以干擾植物體內(nèi)激素的平衡，破壞核酸和蛋白質(zhì)的代謝，從而抑制胚乳向生長旺盛的愈傷組織進(jìn)行脫分化。在培養(yǎng)基中添加酵母提取物、水解酪蛋白等外源有機(jī)物，可以在繼代培養(yǎng)時(shí)有效促進(jìn)愈傷組織的改造與增殖，這是由于它們富含多肽、氨基酸、核苷酸、維生素、微量元素等營養(yǎng)成分，且比例協(xié)調(diào)，尤其是其所含的一些生長因子成分，可以對愈傷組織的生長、改造、再分化等具有較好的促進(jìn)作用[19]。

參考文獻(xiàn)：

[1]冉懋雄. 杜仲[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[2]張康健，趙德義，董娟娥. 風(fēng)靡全球的杜仲健康新理念[M]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，2005.

[3]趙玉英，耿權(quán)，程鐵民. 杜仲化學(xué)成分研究概況[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1995，7（3）：46-52.

[4]林春玲，岳紅，瞿潤. 形狀記憶材料杜仲膠的特性及研究進(jìn)展[J]. 材料導(dǎo)報(bào)，2007，11（增刊3）：374-376.

[5]Hayman E P，Yokoyama H，Bai K Z. Stimulation of plant growth and gutta content in Eucommia ulmoides Oliv. by 2-diethylaminoethyl-3，4-dichlo-rophenylther[J]. Plant Growth Regulation，1994，14：78-82.

[6]華會明，尹宏權(quán)，李寶強(qiáng)，等. 杜仲化學(xué)成分的研究[J]. 分子植物育種，2003，1（增刊1）：801-803.

[7]李俊紅. 杜仲組織培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化與多倍體誘導(dǎo)[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[8]朱登云，田慧琴，蔣金火，等. 杜仲成熟干胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，1998，6（4）：3-8.

[9]Thomas T D，Bhatnagar A K，Bhojwani S S. Production of triploid plants of mulberry（Morus alba L.） by endosperm culture[J]. Plant Cell Reports，2000，19（4）：395-399.

[10]黃勇. 杜仲組織培養(yǎng)的初步研究[D]. 武漢：華中師范大學(xué)，2003.

[11]李琰，張朝紅，崔宏安，等. 杜仲愈傷組織誘導(dǎo)的研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，31（5）：153-157.

[12]李琰，張朝紅，崔宏安. 激素對杜仲幼莖愈傷組織誘導(dǎo)及生長的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，32（1）：57-60.

[13]Zhang H F，Guo B L，Zhang C H，et al. Induction and identification of tetraploids in Eucommia ulmoides Oliv.[J]. Acta Horticulturae Sinica，2008，35（7）：1047-1052.

[14]張海鳳，鄭輝，陳新華，等. 藥用植物多倍體研究進(jìn)展[J]. 河北林果研究，2008，23（2）：169-172，175.

[15]余桂紅，張旭，孫曉波，等. 大麥蘇啤4號幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)及植株的高頻再生[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（5）：953-956.

[16]曾愛松，宋立曉，高兵，等. 結(jié)球甘藍(lán)小孢子胚植株再生體系的優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（1）：228-230.

[17]石虎，楊永智，周云，等. 馬鈴薯新品種青薯9號高效再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：14-19.

[18]杜敏華，柯濤，韓雪梅，等. 連香樹下胚軸高頻離體再生體系的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（10）：47-49.

[19]張紅曉，經(jīng)劍穎. 木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)學(xué)版，2003，23（3）：66-69.韓延如，寧萬光，史洪中，等. 土壤水分對水稻籽粒相對充實(shí)度的影響及其與產(chǎn)量的關(guān)系[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（9）：93-96.