葉日英，伍　彬，陳海燕

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

產(chǎn)酸優(yōu)勢(shì)醋酸菌的分離及其增殖產(chǎn)酸與乙醇的灰色關(guān)聯(lián)分析

葉日英，伍彬，陳海燕

（廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

為了從自然界中分離得到產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的醋酸菌，并明確發(fā)酵基質(zhì)中乙醇濃度對(duì)醋酸菌細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量的相關(guān)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)以腐爛的菠蘿果實(shí)為原料進(jìn)行醋酸菌分離純化，選取溶鈣圈較大的菌落進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸對(duì)比實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過對(duì)發(fā)酵液含酸量的測(cè)定，找出產(chǎn)酸量最大的菌株，然后將目標(biāo)菌分別接種到不同乙醇濃度的發(fā)酵液進(jìn)行恒溫發(fā)酵，經(jīng)過一定時(shí)間后檢測(cè)各個(gè)發(fā)酵液的醋酸菌細(xì)胞總量和產(chǎn)酸量，所得數(shù)據(jù)用灰色關(guān)聯(lián)分析法處理，通過計(jì)算獲得醋酸菌細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量與乙醇濃度的關(guān)聯(lián)度，并比較兩者的關(guān)聯(lián)序。實(shí)驗(yàn)結(jié)果獲得一株產(chǎn)酸能力相對(duì)較強(qiáng)的醋酸菌S1，發(fā)酵液乙醇濃度與S1產(chǎn)酸量和細(xì)胞增殖的關(guān)聯(lián)度分別是0.655、0.517。結(jié)果表明：乙醇對(duì)S1產(chǎn)酸量關(guān)聯(lián)顯著（關(guān)聯(lián)度＞0.6），而對(duì)S1細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)不顯著（關(guān)聯(lián)度＜0.6），乙醇對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸的影響效果大于對(duì)其細(xì)胞增殖的影響。

醋酸菌，細(xì)胞增殖，產(chǎn)酸量，乙醇，灰色關(guān)聯(lián)分析

醋酸菌是專性好氧細(xì)菌，能把乙醇氧化為醋酸，是食品工業(yè)上用于發(fā)酵生產(chǎn)醋酸的菌種。由于醋酸對(duì)人體具有重要的保鍵作用，如預(yù)防高血壓、高血脂、脂肪肝和糖尿病［1］等等，所以醋酸一直受到人們的重視。很早以前人們主要把醋作為調(diào)味品食用，隨著生活水平的提高，人們對(duì)醋的需求不再滿足于純粹的調(diào)味作用，更多地追求醋酸新產(chǎn)品，現(xiàn)在已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模開發(fā)和生產(chǎn)醋酸飲料，其中最大宗的是水果發(fā)酵醋飲料如蘋果醋飲料、紅棗醋飲料和菠蘿醋飲料等等，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)食醋的年產(chǎn)量約為200～250萬(wàn)噸［2］。由于食醋是由醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的，所以醋酸菌是生產(chǎn)食醋最關(guān)鍵的條件，目前我國(guó)用于食醋生產(chǎn)的醋酸菌主要是中科1.41及滬釀1.01菌株，均為醋酸桿菌屬細(xì)菌。為了追求產(chǎn)醋酸能力較大、產(chǎn)醋酸口感質(zhì)量更好的醋酸菌種，研究人員一直致力于探索和研究新的醋酸菌種［3-8］。醋酸菌在自然界的分布很廣泛，在未滅菌的醋、啤酒、黃酒、果酒以及成熟或腐敗的水果中都有醋酸菌生長(zhǎng)［9-10］。為了得到口感質(zhì)量較好，醋酸產(chǎn)量較大的醋酸發(fā)酵技術(shù)，研究人員從發(fā)酵溫度、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和基質(zhì)成分等方面進(jìn)行了許多研究［11］，相關(guān)的研究報(bào)道證明，發(fā)酵基質(zhì)的乙醇濃度對(duì)醋酸菌的發(fā)酵產(chǎn)酸影響較大［12-13］，但對(duì)乙醇影響醋酸菌發(fā)酵的機(jī)理過程的目前未見有研究報(bào)道。因?yàn)榇姿峋l(fā)酵過程主要是不斷地進(jìn)行細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸的過程，據(jù)此本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)用腐爛的菠蘿果實(shí)分離醋酸菌，通過產(chǎn)酸對(duì)比實(shí)驗(yàn)尋找產(chǎn)酸能力相對(duì)較強(qiáng)的菌株，然后進(jìn)一步對(duì)分離得到的菌株作不同乙醇濃度的培養(yǎng)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)醋酸菌在不同乙醇濃度中細(xì)胞的增殖量和產(chǎn)酸量，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用灰色關(guān)聯(lián)分析法（Grey Relational Analysis）處理［14］，通過計(jì)算細(xì)胞增殖量和產(chǎn)酸量與乙醇濃度的關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序，從而確定乙醇對(duì)醋酸菌細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量影響效果的大小。

灰色關(guān)聯(lián)理論是通過一定的方法，尋求在一個(gè)系統(tǒng)發(fā)展中幾個(gè)因素之間的數(shù)值變化關(guān)系，其意義是指在系統(tǒng)發(fā)展過程中，如果兩個(gè)因素的同步變化程度越高，則其關(guān)聯(lián)度就越大，反之關(guān)聯(lián)度越小，灰色關(guān)聯(lián)分析法可以為一個(gè)系統(tǒng)中幾個(gè)因素的發(fā)展態(tài)勢(shì)作出量化的比較?；疑P(guān)聯(lián)分析法是進(jìn)行科研實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和分析的較好方法，得到廣大科研工作者的喜愛和應(yīng)用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于社會(huì)科學(xué)、微生物學(xué)和毒理學(xué)研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析［14-15］。由于醋酸菌的發(fā)酵過程是不斷地進(jìn)行細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸的過程，因此，利用灰色關(guān)聯(lián)分析法計(jì)算乙醇濃度分別與醋酸菌的細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量的灰色關(guān)聯(lián)度，得到乙醇分別對(duì)醋酸菌的細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量影響程度的量化比較，就能明確乙醇對(duì)醋酸菌發(fā)酵效果影響的關(guān)鍵原因。

1　材料與方法

1.1材料與設(shè)備

腐爛菠蘿取自湛江市徐聞菠蘿種植園；分離用培養(yǎng)基葡萄糖1%、酵母膏1%、無(wú)水乙醇3%、瓊脂2%、CaCO32%，自然pH；液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基葡萄糖1%、酵母膏1%、無(wú)水乙醇6%，pH 5.5；上述的試劑均購(gòu)買于北京陸橋技術(shù)責(zé)任有限公司，為化學(xué)純。

SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱金壇市萬(wàn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠；L1100A型生物顯微鏡廣州粵顯光學(xué)儀器有限責(zé)任公司；2-16K型離心機(jī)Sigma公司；GZX-9140MBE型立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1增菌培養(yǎng)及醋酸菌的分離取10g腐爛菠蘿搗碎后加入盛有100m L液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，置于32℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中增殖培養(yǎng)3d后，吸取1m L加入裝有9m L的無(wú)菌生理鹽水的試管中，制成濃度梯度為10-1的菌懸液，然后逐步稀釋至10-5、10-6、10-7濃度梯度，吸取后三個(gè)濃度梯度的稀釋液各0.2m L，用傾注法接種于分離培養(yǎng)基，每個(gè)梯度2個(gè)平板，32℃恒溫培養(yǎng)2～3d后觀察。根據(jù)醋酸菌在分離培養(yǎng)基上是否產(chǎn)生溶鈣圈初步定性［14］，若產(chǎn)生溶鈣圈，則初步定為醋酸菌；從不同的稀釋度的平板中挑取溶鈣圈較大、長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落進(jìn)行純化［16-17］。

1.2.2產(chǎn)醋酸定性實(shí)驗(yàn)根據(jù)醋酸菌培養(yǎng)液與FeCl3溶液反應(yīng)進(jìn)行醋酸定性實(shí)驗(yàn)［17］。取活化好的斜面菌種一環(huán)，分別接種于100m L基礎(chǔ)液態(tài)培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)箱靜置淺層培養(yǎng)72h。利用離心機(jī)除去菌體，取5m L除去菌體的培養(yǎng)液于小燒杯中，用0.1mol/L NaOH溶液中和至中性，然后加入5～6滴5.0%的三氯化鐵溶液，若形成紅褐色沉淀則此菌株可鑒定為醋酸菌［19］。

1.2.3產(chǎn)酸優(yōu)勢(shì)菌株的確定將初篩得到的菌株接種于液態(tài)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，每株菌平行3組，于32℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后，利用醋酸定量測(cè)定法測(cè)定發(fā)酵液中的醋酸含量：精確吸取發(fā)酵液2m L至250m L三角瓶中，并加入蒸餾水50m L，滴加3～5滴0.5%的酒精酚酞溶液，用已標(biāo)定過的0.1mol/L NaOH溶液滴定至微粉色。由消耗的NaOH溶液的體積計(jì)算樣品中的含酸量（以醋酸計(jì)），確定產(chǎn)酸量大的醋酸菌［20-21］。

產(chǎn)酸量（g/L）=（V-V0）×CNaOH×60/L

式中：V—為發(fā)酵液樣品滴定消耗的NaOH溶液的體積m L；V0—以空白培養(yǎng)基為對(duì)照滴定消耗的NaOH溶液的體積m L；CNaOH—NaOH溶液的濃度（mol/L）；L—樣品體積；60—為醋酸分子量。

1.2.4乙醇濃度對(duì)醋酸菌細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸的影響選取產(chǎn)酸優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行不同乙醇濃度發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：取醋酸菌3環(huán)，接入20m L生理鹽水（20m L/250m L三角瓶）中充分振蕩搖勻，以2%接種量接種于基礎(chǔ)液態(tài)培養(yǎng)基32℃培養(yǎng)48h，然后將種子液以5%的接種量分別接種于具有不同酒精濃度的100m L液態(tài)培養(yǎng)基的三角瓶中，其中的酒精度分別為3%vol、6%vol、9%vol、12%vol、15%vol、18%vol，于32℃振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)6d后，將發(fā)酵液離心（10000r/m in，15m in）沉淀，把醋酸菌細(xì)胞和發(fā)酵液分離，取上清液測(cè)定含酸量，并稱取沉淀出來(lái)濕菌體重量，每個(gè)乙醇濃度2個(gè)平行，考察酒精濃度對(duì)醋酸菌生長(zhǎng)和產(chǎn)酸的影響。

1.2.5數(shù)據(jù)處理分析法將不同乙醇濃度發(fā)酵液所測(cè)得的醋酸菌細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量數(shù)據(jù)，根據(jù)灰色關(guān)聯(lián)分析法原理，分別進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析計(jì)算。

2　結(jié)果與討論

2.1分離得到的醋酸菌菌落和細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)過平板分離培養(yǎng)48h得到菌落如圖1所示，菌落的顏色白色或略帶微黃，半透明或不透明，個(gè)體非常小，表面光滑濕潤(rùn)，所產(chǎn)的醋酸使碳酸鈣溶解形成明顯的透明圈。將菌落作平板劃線純化分離培養(yǎng)后得到三株菌，分別命名為S1、S2、S3，菌落特征如圖2所示，從劃線培養(yǎng)的菌落可以看到醋酸菌產(chǎn)生的醋酸使平皿底部的碳酸鈣溶解形成明顯的透明區(qū)域；將三株菌鏡檢，觀察到S1和S2細(xì)胞都是明顯的桿狀形，S1細(xì)胞呈鏈狀排列，較粗大，S2呈對(duì)狀排列，桿狀較細(xì)小，S3細(xì)胞呈橢圓形（圖3），用三株菌的發(fā)酵液作醋酸定性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有紅褐色現(xiàn)象，確認(rèn)所得到三株菌都產(chǎn)醋酸［22］。

圖1　腐爛菠蘿中分離的醋酸菌菌落Fig.1　The separated acetic bacteria colony of rot pineapple

圖2　3株菌劃線培養(yǎng)的醋酸菌菌落Fig.2　Three strains of acetic bacterias colony with lineation inoculate

圖3　三株醋酸菌的鏡檢細(xì)胞形態(tài)圖Fig.3　The cellularmorphologymicroscopic of three strains acetic bacterias

2.2醋酸菌產(chǎn)酸優(yōu)勢(shì)菌株確定

將分離得到的3株醋酸菌用液態(tài)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，通過發(fā)酵液的醋酸含量檢測(cè)，結(jié)果S1、S2、S3菌株的產(chǎn)酸量分別是22.23、8.15、13.70g/L，S1菌產(chǎn)酸量較大，因此選擇S1菌進(jìn)行乙醇濃度影響實(shí)驗(yàn)［23］。

2.3乙醇濃度對(duì)S1菌細(xì)胞繁殖和產(chǎn)酸量的影響

選取31℃為發(fā)酵溫度，將基礎(chǔ)發(fā)酵液改變乙醇濃度時(shí)S1菌發(fā)酵6d細(xì)胞生長(zhǎng)總量及產(chǎn)酸量分別如表1所示。

表1　不同酒精濃度下S1發(fā)酵液的細(xì)胞濕重及產(chǎn)酸量Table 1　The cellwetweightand acid yield of S1 fermentationbroth on differentalcohol concentration

表1的結(jié)果說(shuō)明S1菌耐酒精能力達(dá)到為9%（V/V），高于這個(gè)濃度時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖受到抑制，同時(shí)產(chǎn)酸量也減少。酒精濃度為9%（V/V）時(shí)可獲得最高的產(chǎn)酸量36.27g/L。

2.4乙醇濃度與S1菌細(xì)胞繁殖和產(chǎn)酸量的灰色關(guān)聯(lián)分析

按照灰色關(guān)聯(lián)分析理論，將醋酸菌的細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量與乙醇濃度、建立動(dòng)態(tài)模型，動(dòng)態(tài)分析的建模方法［15］如下：

以乙醇濃度為參考數(shù)列，產(chǎn)酸量和細(xì)胞濕重為比較數(shù)列，建立原始數(shù)列，參考數(shù)列記作（y0代表乙醇濃度參考數(shù)列；k是實(shí)驗(yàn)組別，k=1，2，3，…6）；比較數(shù)列記作（yi代表產(chǎn)酸量和細(xì)胞濕重兩個(gè)比較數(shù)列，i= 1，2）按下列公式將原始數(shù)列的數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，以消除數(shù)量單位和級(jí)別不同所帶來(lái)的影響，得到式（1），公式中的和Si分別表示平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

計(jì)算每個(gè)時(shí)刻點(diǎn)的參考數(shù)列與比較數(shù)列差的絕對(duì)值，并找出最大的和最小的差絕對(duì)值，得到差的絕對(duì)值序列，記作△i（k）最大差△max=；最小差△min=mix

計(jì)算相關(guān)系數(shù)按式（2）計(jì)算，關(guān)聯(lián)系數(shù)的意義是指在某個(gè)時(shí)刻子因素與母因素的相對(duì)差值，ρ是分辯系數(shù)，取值在0～1之間，通常取0.5。

計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)度：根據(jù)相關(guān)系數(shù)，按公式（3）利用算術(shù)平均法計(jì)算出灰色關(guān)聯(lián)度，關(guān)聯(lián)度越接近1，說(shuō)明兩因素關(guān)聯(lián)度越大，當(dāng)ρ=0.5時(shí)，關(guān)聯(lián)度≥0.6，就表示關(guān)聯(lián)性顯著［24］。利用灰色關(guān)聯(lián)分析模型，根據(jù)表1的數(shù)據(jù)，經(jīng)過數(shù)值無(wú)量綱化法處理后得到數(shù)值如表2所示。

表2　不同乙醇濃度的細(xì)胞濕重及產(chǎn)酸量無(wú)量綱化表Table 2　The cellwetweightand acid yield on differentalcohol concentration with dimensionlessmethod

表3　乙醇濃度與細(xì)胞濕重和酸含量的關(guān)聯(lián)數(shù)值表Table 3　The relevance between alcohol concentration and cellwetweightand acid yield

根據(jù)無(wú)量綱化表數(shù)據(jù)，用matlab編程計(jì)算得到關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度如表3所示。

由表3中乙醇濃度影響醋酸菌細(xì)胞增殖和產(chǎn)酸量的灰色關(guān)聯(lián)計(jì)算結(jié)果看出，發(fā)酵液乙醇濃度對(duì)細(xì)胞增殖的關(guān)聯(lián)度為0.517（＜0.6），說(shuō)明關(guān)聯(lián)不顯著，而對(duì)產(chǎn)酸量的關(guān)聯(lián)度為0.655（＞0.6），說(shuō)明關(guān)聯(lián)顯著。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明乙醇對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸量的作用效應(yīng)大于對(duì)細(xì)胞增殖作用效應(yīng)。

3　結(jié)論

從腐爛菠蘿中分離篩選得到一株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)醋酸菌S1，S1在基礎(chǔ)液態(tài)培養(yǎng)基中發(fā)酵能達(dá)到22.23g/L，耐乙醇濃度最高達(dá)9%（vol）；發(fā)酵基質(zhì)的乙醇濃度與醋酸菌細(xì)胞增殖關(guān)聯(lián)不顯著，而與醋酸菌產(chǎn)酸量關(guān)聯(lián)顯著，因此，發(fā)酵基質(zhì)的乙醇濃度對(duì)醋酸菌產(chǎn)酸量影響程度較大，對(duì)醋酸菌細(xì)胞增殖的影響作用較小。

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The separation of acetic bacteria advantage lies in acid production and the grey relationalanalysis on its proliferation and acid production w ith ethylalcohol

YE Ri-ying，WU Bin，CHEN Hai-yan
（College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

In order to get acetic bacterial strain which had advantage lays in acid p roduction from nature，c lear and definite the relationship between its acid p roduction，cell p roliferation and ethanol concentration of fermentation substrate.In the experiment acetic bac teria was separation and purification w ith rotten pineapp le，the bacterial colony which had bigger solub le calcium circ le was selected and put into fermentation for acid p roduction.Then the strain which had the highest acid p rodution was found out after determ ined acid content of fermentation b roth.It was put into the fermentation experiment on constant tem perature w ith a series of alcohol concentration.After a time the cell p roliferation and acid p roduction were detec ted.Datas of these was put into analysis based on the g rey relational analysis，by calculation two relevancies between alcohol concentration and acid p roduction and cell p roliferation were acquired.And their relational sequence was put into compare.As the result，a acetic bacterial strain S1 which had advantage lies in acid p roduction was got out，the relationaldegree between acid p roduction，cellp roliferation of S1 and alcohol concentration respectively was 0.670 and 0.517.The results showed that the correlation was outstanding between acid p roduction of S1 and alcohol concentration（relational degree＞0.6），and the correlation was non-significant between cell p roliferation and alcohol concentration（relational deg ree＜0.6）.The effect of ethyl alcohol for acid p roduction was greater than that for cellp roliferation.

acetic bacteria；cellp roliferation；acid p roduction；ethylalcohol；the g rey relationalanalysis

TS201.1

A

1002-0306（2015）06-162-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.06.028

2014-05-08

葉日英（1965-），女，本科，研究方向：食品科學(xué)與工程。

廣東省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（2010B020313004）；廣東省湛江市科技局科技攻關(guān)項(xiàng)目（2012C3104001）。