胡春龍等

摘要：以山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗站收集的46份白蠟為試驗材料，對白蠟種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建進行探究。利用SSR標記技術(shù)對白蠟試材進行區(qū)分，從150對引物中篩選出11對SSR引物對選定白蠟試材進行擴增，每個引物可以檢測到3～5個基因型，平均每對引物擴增出2.52條帶和2.09條多態(tài)性帶，平均多態(tài)性位點百分率為82.93%。將11對引物及其檢測出的等位基因依次賦值，構(gòu)建了供試白蠟種質(zhì)資源的分子身份證，能夠達到區(qū)分各品種的目的。

關(guān)鍵詞：白蠟；SSR；分子身份證

中圖分類號：S687.1∶Q781文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2015）05-0006-05

Establishment of Molecular ID for Fraxinus

Germplasms Based on SSR Markers

Hu Chunlong1， Zhang Chen1， Liu Cuilan2，3， Li Li2，3，

Yan Liping2，3， Wu Dejun2，3， Xia Yang2，3， Xing Shiyan1， Wang Kaifang2*

（1.College of Forestry， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China； 2.Shandong Academy of Forestry，

Jinan 250014，China； 3.Shandong Provincial Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement， Jinan 250014， China）

AbstractUsing 46 Fraxinus materials from the Shouguang Experimental Station of Shandong Academy of Forestry， the establishment of molecular ID for Fraxinus germplasms was studied. These Fraxinus materials were distinguished by SSR markers. Eleven pairs of primers screened from 150 pairs were used to amplify the selected Fraxinus materials. The results showed that 3～5 genotypes could be detected by each primer. The average number of bands and polymorphic bands were 2.52 and 2.09 amplified by every pair of primers. The average polymorphic loci percentage was 82.93%. After assignment of 11 pairs of primers and their alleles， the molecular IDs were established for the tested Fraxinus germplasms， which could well distinguish the varieties of Fraxinus.

Key wordsFraxinus velutina Torr； SSR； Molecular ID

白蠟（Fraxinus sp.）屬雙子葉植物綱，木犀科（Oleceae），木犀亞科（Oleoideae）。目前發(fā)現(xiàn)的白蠟約有70多種，在我國已見約34種。白蠟樹耐鹽堿、干形出眾，作為一種常見綠化樹種，在我國分布廣泛。由于白蠟種質(zhì)資源種類繁多，品種的鑒定引起研究者廣泛關(guān)注。20世紀80年代末，微衛(wèi)星標記技術(shù)（SSR）的不斷發(fā)展和完善為白蠟種質(zhì)資源分子層面的鑒定奠定了基礎(chǔ)。

SSR微衛(wèi)星標記分布比較均勻、穩(wěn)定性較高、重復(fù)性好且多態(tài)性豐富，在擬南芥等植物中的編碼區(qū)、非編碼區(qū)均廣泛存在，為種質(zhì)資源的純度及品種真實性鑒定提供理論依據(jù)。近年來，部分學(xué)者通過SSR技術(shù)在荔枝、黑核桃等植物上取得一定進展，并成功構(gòu)建了大豆、香蕉、甘蔗、梨和桃等種質(zhì)資源的分子ID。然而到目前為止，SSR標記技術(shù)在白蠟上還鮮有應(yīng)用。本研究利用SSR標記技術(shù)，以山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗站保存的46份白蠟為試材，運用相關(guān)軟件進行分析，通過分子層面的研究，以期為探究構(gòu)建白蠟種質(zhì)分子身份證的方法提供理論依據(jù)，為白蠟新品種的審定、DUS測試、分子標記輔助育種等奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

選用山東省林業(yè)科學(xué)研究院壽光試驗站收集保存的46份白蠟為試材（表1）。

1.2白蠟基因組DNA提取

取白蠟試材的新鮮葉片置于-50℃保存，采用改進CTAB法提取白蠟基因組DNA。

1.3DNA檢測方法

將提取的白蠟基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)EB染色后在紫外燈下拍照，檢測是否有DNA條帶。利用微量分光光度計檢測DNA質(zhì)量，將DNA按1∶50稀釋，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物的合成與PCR反應(yīng)

SSR引物為山東省林業(yè)科學(xué)研究院通過轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)合成的白蠟特異性引物，由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系為10 μL，包含：Mg2+（25 mmol/L）0.1 μL、正反向引物（10 μmol/L）各1 μL、模板DNA（10 ng/μL）為1 μL，Taq酶（5 U/μL）5 μL，用ddH2O補足至10 μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過固定、銀染、漂洗、顯影等步驟后獲得相應(yīng)的指紋圖譜，統(tǒng)計數(shù)據(jù)后通過軟件進行分析。endprint

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

根據(jù)所得的指紋圖譜對應(yīng)的分子量統(tǒng)計，依次記錄為數(shù)字1、2、3、…、m，統(tǒng)計軟件采用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)研發(fā)的Genetics Statistics 3.0 （登記號為2007SR11872）、IDAnalysis 1.0，分別用于引物的多樣性指數(shù)、shannon多樣性指數(shù)（I）的分析和白蠟試材分子身份證的構(gòu)建。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取

由圖1可以看出，DNA條帶較亮，說明提取的白蠟基因組DNA純度較高，符合試驗基本要求。

2.2多態(tài)性引物的篩選

多態(tài)性高的引物可以更清晰地展示不同染色體上的信息，在46份試材中隨機選取10個白蠟品種對150對引物進行篩選，得到11對條帶清晰、特異性較強的引物。

2.3引物等位基因信息分析

利用篩選出的11對引物對46份白蠟DNA依次進行PCR擴增，根據(jù)圖譜進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。

根據(jù)擴增得到的指紋圖譜分析得知：平均每對引物擴增出2.52條帶和2.09條多態(tài)性帶，平均多態(tài)性位點百分率為82.93%。每對引物可以檢測到3～5個等位基因，引物多樣性指數(shù)介于0.486～0.879之間，平均為0.606。其中，等位基因數(shù)大于平均值的引物有：Y132、Y064、Y077、Y082、Y124、Y083、Y112、Y093；多樣性指數(shù)高于平均值（4.6）的引物有：Y132、Y150、Y112（見表2）。Shannon多樣性指數(shù)（I）的變化范圍在0.9717～1.4017，平均為1.1996，說明供試的白蠟屬群體中存在較高的遺傳多樣性。

2.4白蠟品種的分子身份證構(gòu)建

分子身份證的構(gòu)建方法一般有兩種，一種是以特異等位基因進行區(qū)分，另一種是以多個引物的等位基因組合區(qū)分。結(jié)果顯示，利用Y132、Y064、Y077、Y082、Y124、Y123、Y150、Y083、Y112、Y093、Y120這11對引物可將供試品種進行區(qū)分（表3）。

例如，表3中構(gòu)建的“白蠟1號”分子身份證為11001311441， 表示在對應(yīng)的引物順序下，第1個引物的第1個等位基因，第2個引物的第1個等位基因，第3個引物顯0個等位基因， 并依此類推， 到第11個引物的第1個等位基因為止， 由這些引物擴增出的特異等位基因組成的指紋圖譜就可以代表相應(yīng)品種的分子身份證。引物的等位基因數(shù)越多，引物在資源鑒別中的作用就越大。引物的多樣性指數(shù)越高，它能區(qū)分品種的能力就越強。

3結(jié)論與討論

本試驗從150對引物中篩選出11對，這些引物的多態(tài)性好且穩(wěn)定性高。多樣性指數(shù)高、特異性強的引物，可以廣泛用于分子身份證的構(gòu)建。許多研究者在統(tǒng)計時通常忽略指紋圖譜中的雜合帶型，采用微衛(wèi)星標記擴增出的一個等位基因位點用于分子身份證的構(gòu)建，而本研究參考了陳昌文等的方法，編碼時只取指紋圖譜中較小的譜帶，通過增加引物的方法構(gòu)建有效分子身份證，使白蠟種質(zhì)資源的區(qū)分能力大幅度提升。目前有些研究者采用的編碼方式是數(shù)字加字母的組合方式，本研究使用純數(shù)字表示等位基因位置的方法，直接將對應(yīng)引物的指紋圖譜按照相應(yīng)的順序進行數(shù)字編碼，由此得到的分子身份證更為簡潔明了。

依據(jù)大麥系指紋圖譜對親本及其子代的SSR分析得知，SSR在不同世代之間的遺傳性狀具有穩(wěn)定性、連續(xù)性。在同一品種中，不同個體的SSR穩(wěn)定性在水稻等物種中也得以證實。因此，利用SSR構(gòu)建分子身份證具有準確可靠、簡單快速、易于自動化的優(yōu)點，然而該方法也有其局限性。有研究者在利用SSR標記技術(shù)構(gòu)建桃的分子身份證時，由于桃的親緣關(guān)系非常接近，難以達到區(qū)分的目的。有關(guān)分子身份證的試驗證實，SSR技術(shù)可以有效區(qū)分來自同一育種單位和源自同一祖先的品種，說明SSR標記可以用于構(gòu)建白蠟的分子身份證。本試驗所得的指紋圖譜的多態(tài)性高、特異性豐富，能夠達到鑒別生物個體之間差異的目的，具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，說明通過指紋圖譜的差異性可以為品種的鑒定提供科學(xué)依據(jù)，這與SSR擴增的目的片段多來自編碼基因之間的序列有關(guān)。本試驗得出的結(jié)論在某種意義上可為供試品種在分子層面上的鑒定提供一定的依據(jù)，后期白蠟品種分子身份證鑒定的普遍適用性還需進一步驗證。

參考文獻：

[1]張美珍，邱蓮卿.中國植物志：第61卷[M].北京：科學(xué)出版社，1992：38.

[2]傅書遐，傅坤俊.中國植物志：第34卷[M].北京：科學(xué)出版社，1984：8-21.

[3]倪國祥，樊寶敏，范玉文. 硶屬13種的苗期形態(tài)物候及生長特性研究[J].山東林業(yè)科技，1996（5）：6-10.

[4]陳漢斌.山東植物志[M].青島：青島出版社，1997：855-891.

[5]劉家宜.天津植物志[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，2004：358-393.

[6]李書心.遼寧植物志[M].沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1992：315-359.

[7]鄭萬鈞.中國樹木志：第2卷[M].北京：中國林業(yè)出版社，1985：1011-1025.

[8]李延生.遼寧樹木志[M].北京：中國林業(yè)出版社，1990：385-388.

[9]周以良.黑龍江樹木志[M].哈爾濱：黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社，1986：482-485.

[10]高運來，朱榮勝，劉春燕，等.黑龍江部分大豆品種分子ID的構(gòu)建[J].作物學(xué)報，2009，35（2）：211-218.

[11]Morgante M，Olivieri A. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics[J]. The Plant Journal，1993，3（1） ： 168-175.endprint

[12]Cardle L，Ramsay L，Milboume D， et al.Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants[J]. Genetics，2000，156（2）：847-854.

[13]Varshney R K， Thiel T， Stein N， et al. In silico analysis on frequency and distribution of microsatellites in ESTs of some cereal species[J].Cell Mol. Biol. Lett.， 2002，7（2A）：537-546.

[14]辛景樹，郭景倫，張軟斌.幾種常用分子標記技術(shù)在種子純度和品種真實性鑒定方面的比較與分析[J].種子，2005，24（1）：58-60.

[15]姚慶榮，趙長增，王文泉.海南部分荔枝種質(zhì)資源親緣關(guān)系的SSR分析[J]. 植物研究，2009，29（5）：628-632.

[16]趙鵬， Wosete K E，程飛，等.美國黑核桃SSR反應(yīng)體系優(yōu)化[J].植物研究，2012，32（2）：213-221.

[17]張飛，王煒勇，張智，等.光萼荷屬植物反應(yīng)體系確立與指紋圖譜構(gòu)建[J].植物研究，2012，32（1）：115-119.

[18]Thomas M R，Scott N S.Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analysed as sequence-tagged sites（STSs）[J].Theor. Appl. Genet.， 1993，86： 985-990.

[19]Thomas M R，Cain P，Scott N S.DNA typing of grapevines： A universal methodology and database for describing cultivars and evaluating genetic relatedness[J]. Plant Mol. Biol.， 1994，25： 939-949.

[20]劉闖萍，王軍.SSR標記及其在葡萄上的應(yīng)用[J].果樹學(xué)報，2008，25（1）：93-101.

[21]吳子龍，王軍，沈育杰，等.山葡萄種內(nèi)遺傳多樣性的SSR分析[J].果樹學(xué)報，2008，25（6）：821-827.

[22]吳子龍，王軍，沈育杰，等.8 個山葡萄及山歐雜種葡萄品種的SSR分析[J].植物遺傳資源學(xué)報，2008，9（1）：105-109.

[23]Snchez-Escribano E M，Martin J P，Carreno J，et al. Use of sequence-tagged microsatellite site markers for characterizing table grape cultivars[J].Genome，1999，42：87-93.

[24]Martinez L E，Cavagnaro P F，Masuelli R W，et al.SSR-based assessment of genetic diversity in South American Vitis vinifera varieties[J].Plant Science，2006，170：1036-1044.

[25]Amold C，Rossetto M，Mcnally J，et al.The application of SSRs characterized for grape（Vitis vinifera） to conservation studied in Vitaceae[J].American Journal of Botany，2002，89（1）：22-28.

[26]艾呈祥，張力思，魏海蓉，等.甜櫻桃品種 SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的建立[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2007，23（5）：55-58.

[27]王健兵，燕麗萍，劉翠蘭，等.白蠟屬SSR-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2009，26（5）：733-738.

[28]楊陽，劉振，趙洋，等.湖南省主要茶樹品種分子指紋圖譜的構(gòu)建[J].茶葉科學(xué)，2010，30（5）：367-373.

[29]劉新龍，馬麗，陳學(xué)寬，等.云南甘蔗自育品種DNA指紋身份證構(gòu)建[J].作物學(xué)報，2010，36（2）：202-210.

[30]韓宏偉，楊敏生，徐興興，等.利用SSR標記鑒定主要梨栽培品種[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22（12）：383-386.

[31]陳昌文，曹珂，王力榮，等.中國桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構(gòu)建[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（10）：2081-2093.

[32]Russell J，F(xiàn)uller J，Young G，et al.Discrimination between barley genotypes using microsatelite markers[J].Genome，1997，40：442-450.

[33]Akagi H，Yokozeki Y，Inagaki A，et al. Highly polyor-phic microsatellites of rice consist of AT repeats and a classification of closely related cultivars with these microsatellite loci[J].Theor.Appl.Genet.，1997，94：61-67.endprint