趙小波等

摘要：本研究利用同源克隆方法，根據(jù)已知植物抗病（R）基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計一對簡并引物，采用RT-PCR方法對花生抗旱品種J11進行擴增，獲得了一個通讀的NBS-LRR類基因片段，命名為PDR1。PDR1長度為474 bp，核苷酸比較分析表明，PDR1與已克隆的大豆抗性基因（XM006573278）相似性為75%，與豌豆（AF123699）、苜蓿（XM003604518）抗性基因的相似性為74%；生物信息學(xué)預(yù)測其全長CDS編碼框為5 838 bp，編碼的蛋白質(zhì)含1 945個氨基酸，含有NB-ARC等保守結(jié)構(gòu)域。熒光定量PCR分析表明，PDR1基因在花生幼苗根、莖、葉中均有表達(dá)，相對表達(dá)量為葉>根>莖；干旱脅迫后PDR1的相對表達(dá)量在12 h達(dá)到頂峰，隨后下降，趨于平穩(wěn)。本研究從花生中成功獲得了NBS-LRR類基因的同源序列，為篩選新的抗旱花生種質(zhì)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：花生； NBS-LRR；同源序列；基因克?。槐磉_(dá)分析

中圖分類號：S565.2：Q781文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2015）05-0001-06

Cloning and Expression Analysis of a NBS-LRR

Resistance Gene in Peanut

Zhao Xiaobo1， Zhang Tingting1， Yan Caixia1， Zhang Hao1，2， Shan Shihua1*， Chen Dianxu1*

（1.Shandong Peanut Research Institute， Qingdao 266100， China； 2.Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

AbstractIn this study， one resistance gene homology fragment was isolated from peanut by homology cloning method. A pair of degenerate primers was designed according to the conserved domains of the known plant disease resistance genes， and then， the fragment with continuous open reading frame was obtained from the peanut variety J11 with drought tolerance by RT-PCR. The sequence was named PDR1. The length of PDR1 was 474 bp. The homology research results showed that the nucleotide of PDR1 was 75% identical to a cloned Glycine max resistance gene （XM006573278）， and 74% identical to the sequences from Pisum sativum （AF123699） and Medicago truncatula（XM003604518）， respectively. By bioinformatics method， it was predicted that the CDS of PDR1 was 5 838 bp， encoding 1 945 amino acids and containing the conserved domain of NB-ARC. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that PDR1 expressed in peanut root， stem and leaves. The relative expression in different organs was leaves > root > stem. After drought stress， the relative expression of PDR1 in J11 reached the peak on the 12th hour， then decreased and moved towards stabilization. The obtain of this resistance homology sequence provided theoretical basis for the screening of drought resistant germplasms form peanut.

Key wordsPeanut； NBS-LRR； Homology sequences； Gene clone； Expression analysis

我國是世界花生生產(chǎn)大國，2007～2013連續(xù)6年總產(chǎn)量增加，達(dá)到1 700×104 t，占世界花生總產(chǎn)的40%以上，居世界第一位，2012年出口14.6萬噸，出口金額一直保持在2億美元以上。但是，花生產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展受到旱災(zāi)的威脅，據(jù)統(tǒng)計我國每年因干旱引起的減產(chǎn)達(dá)30%～50%。除減產(chǎn)外，干旱還有可能導(dǎo)致花生黃曲霉毒素污染、品質(zhì)下降等一系列后果。所以，選育抗旱、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)花生品種是花生育種工作的重要方向之一。

研究花生的抗旱機制是花生抗旱育種的基礎(chǔ)，目前一些NBS-LRR類基因被認(rèn)為在花生抗旱過程中起到一定的作用。NBS-LRR類基因（nucleotide binding site-leucine-rich repeat）是R基因（抗病基因， resistance genes）中最大的類群，其蛋白產(chǎn)物含一個NBS和一個LRR結(jié)構(gòu)域，NBS結(jié)構(gòu)域具有4個高度保守的基序。目前，大多數(shù)NBS-LRR類基因是根據(jù)植物抗病基因保守序列結(jié)構(gòu)特點設(shè)計引物擴增基因組DNA或cDNA獲得的。僅國內(nèi)，就已在水稻、擬南芥、毛果楊、大豆和小麥等植物中成功擴增了許多抗病基因同源片段。在花生NBS-LRR類基因研究領(lǐng)域，Yuksel等做了大量的工作，取得了重要的成果，他的團隊設(shè)計了4對簡并引物和2對特異引物，總計獲得了234個具有開放閱讀框的NBS-LRR類基因片段；晏立英等利用已知的NBS保守區(qū)域設(shè)計引物，從中花6號中獲得了5條具有連續(xù)ORF的抗病基因序列。但是，相對于植物基因組中的NBS-LRR類基因數(shù)量，目前已知的該類基因數(shù)目仍然較少，需要設(shè)計新的引物或采用其他方法去獲得。endprint

本研究根據(jù)已克隆的植物抗病基因NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域，參考已有研究成果設(shè)計簡并引物，從花生品種J11的cDNA中獲得抗病基因同源序列，并進行同源性比較及功能驗證，為今后花生抗旱種質(zhì)的篩選奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料與處理

供試花生材料抗旱品種J11、不耐旱品種JH1012為山東省花生研究所提供，試驗所用材料為當(dāng)年田間種植樣品。取飽滿一致的高活力花生種子各10粒，放在滅菌培養(yǎng)皿中置于人工培養(yǎng)箱，使用Hoagland營養(yǎng)液。人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件設(shè)置為：27℃，光照強度2 000 lx，光照周期為16L∶8D。培養(yǎng)10天后取新鮮葉片，用液氮速凍，并保存于-80℃冰箱待用。

對27℃正常培養(yǎng)的J11花生幼苗進行15% PEG 6000溶液模擬干旱處理，分別取處理前（0 h）及處理后6、12、18 h和24 h幼苗第1片復(fù)葉；同時采集正常狀態(tài)J11花生幼苗的莖、根、葉，液氮速凍后于-80℃保存，用于熒光定量PCR分析。試驗設(shè)3次重復(fù)。

1.2葉片總RNA的提取和cDNA第一鏈合成

總RNA提取采用楊晨等的方法，略有改進。用紫外分光光度計（AA-680，日本島津） 檢測RNA濃度并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。cDNA第一鏈的合成采用Vazyme的HiScript第一鏈cDNA合成試劑盒。

1.3NBS-LRR類基因片段獲得

根據(jù)NBS類抗病基因編碼的蛋白質(zhì)保守區(qū)域P-loop和GLPL設(shè)計一對簡并引物，引物序列見表1。以花生抗旱品種J11、不耐旱品種JH1012的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系為20 μL，包含10×PCR buffer 2 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Taq（0.5 U/μL）0.2 μL，引物（10 mmol/L）各0.5 μL，模板1 μL，ddH2O補足至20 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，40個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

1.4測序與序列比較

測序委托南京金絲瑞生物技術(shù)公司完成。序列數(shù)據(jù)首先與GenBank中已有序列信息進行比對。然后利用ClustalW軟件對測序數(shù)據(jù)進行人工對齊排序。選擇Kimura 2-parameter公式計算遺傳距離。并在MEGA6.0中采用鄰近法（Neighbor-Joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)樹，自舉值Bootstrap為1 000次重復(fù)。

1.5熒光定量RT-PCR分析

根據(jù)擴增得到的序列，用Prime 5.0設(shè)計熒光定量PCR特異引物，分別為YG1： 5′-TCACGACAAGAGATAGAAG-3′； YG2： 5′-TCCAGCATAAGCAACTACAT-3′，以花生肌動蛋白基因（actin）為內(nèi)參基因，引物序列為Actin-F： 5′-GAGGAGAAGCAGAAGCAAGTTG-3′；Actin-R： 5′-AGACAGCATATCGGCACTCATC-3′。在7500FAST熒光定量PCR儀（ABI公司）上對花生干旱脅迫的葉片，以及正常狀態(tài)根、莖、葉目的基因表達(dá)情況進行分析。反應(yīng)條件為 95℃ 10 s； 95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40個循環(huán)；繪制溶解曲線，溫度每10 s升高0.5℃。

2結(jié)果與分析

2.1花生NBS-LRR類基因片段分離與同源片段的聚類分析

根據(jù)NBS-LRR類基因保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計一對簡并引物S1、S2，對反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行擴增，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在J11中獲得部分條帶（圖1），參考已有研究經(jīng)驗，選取其中一條約500 bp的條帶進行回收，克隆測序（在JH1012中未獲得該片段）。經(jīng)測序，該片段為一條通讀序列，長度為474 bp，命名為PDR1。

2.2PDR1的生物信息學(xué)分析

利用花生全基因組相關(guān)數(shù)據(jù)（未公布）找到PDR1所在的一個基因組contig，將相關(guān)信息輸入GENSCAN網(wǎng)站（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html），預(yù)測其全長CDS編碼框。預(yù)測結(jié)果顯示，PDR1全長CDS編碼框為5 838 bp，編碼的蛋白質(zhì)含1 945個氨基酸，其中丙氨酸87個，占4.47%；半胱氨酸28個，占1.44%；天冬氨酸116個，占5.96%；谷氨酸137個，占7.04%；苯丙氨酸85個，占4.37%；甘氨酸113個，占5.81%；組氨酸47個，占2.42；異亮氨酸141個，占7.25%；賴氨酸132個，占6.79；亮氨酸222個，占11.41%；蛋氨酸38個，占1.95；天冬酰胺84個，占4.32%；脯氨酸51個，占2.62%；谷氨酰胺79個，占4.06%；精氨酸111個，占5.71%；絲氨酸170個，占8.74%；蘇氨酸82個，占4.22%；纈氨酸142個，占7.30%；色氨酸24個，占1.23%；酪氨酸56個，占2.88%。

通過DNAMAN軟件預(yù)測出PDR1編碼蛋白的分子量大小為221.248 kD、等電點為7.02。由TMpred程序預(yù)測PDR1編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)合區(qū)域，發(fā)現(xiàn)由內(nèi)到外、由外到內(nèi)的跨膜區(qū)域均為13個（圖3）。根據(jù)NCBI上的Conserved Domain Search，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有NB-ARC等保守結(jié)構(gòu)域（圖4）。

2.3PDR1基因表達(dá)分析

通過熒光定量PCR分別檢測花生品種J11根、莖、葉以及干旱脅迫下葉中PDR1的表達(dá)情況。從圖5中可以看出，正常情況下，PDR1基因在花生根、莖和葉中均有表達(dá)，其中葉中的相對表達(dá)量顯著高于根（P<0.05），莖中的相對表達(dá)量最低。endprint

干旱脅迫之后葉中PDR1的表達(dá)情況見圖6。0～12 h，基因的相對表達(dá)量處于上升階段，與對照（0 h）相比，6 h的相對表達(dá)量達(dá)顯著差異（P<0.05），12 h的表達(dá)量達(dá)極顯著差異（P<0.01），在12 h達(dá)到頂峰，隨后下降，18 h與24 h之間無顯著差異（P>0.05），處于平穩(wěn)表達(dá)階段。

3討論與結(jié)論

NBS-LRR類基因是目前發(fā)現(xiàn)的最重要的抗性基因，現(xiàn)有的工作已經(jīng)證明根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計引物進行同源序列的克隆是可行的。本研究所獲得的PDR1基因片段與已知NBS-LRR類基因具有較高的相似性，也證明了這一點。目前的許多工作是從基因組DNA中克隆該類基因，但是由于基因組DNA含有內(nèi)含子，相對復(fù)雜，因此分離的NBS-LRR類基因可能有一些是不表達(dá)的假基因。魏芳等從小麥基因組中克隆了NBS-LRR類基因，經(jīng)鑒定43個陽性重組子中有11個為假基因。Yuksel等利用花生基因組克隆NBS-LRR類基因，獲得了1 028條克隆序列，但是其中只有234個通讀序列。還有研究顯示，擬南芥中發(fā)現(xiàn)的149個NBS-LRR類基因中12條是假基因；水稻中存在約500個NBS-LRR基因，其中超過100條被認(rèn)為是假基因。因此，在今后的工作中，應(yīng)使用RT-PCR的方法進行同源克隆，以避免假基因的干擾。

NBS-LRR類基因通常分為兩大類，即TIR類和nonTIR類。TIR類N端為人白細(xì)胞介素1和果蠅的Toll樣受體（即TIR）結(jié)構(gòu)，如煙草的N抗性基因。nonTIR類N端為亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，如番茄抗根結(jié)線蟲病基因Mi。Meyers等認(rèn)為，含有TIR的NBS-LRR類基因蛋白Kinase-2最后一個氨基酸殘基通常為天冬氨酸（D），也可以是任意氨基酸；而nonTIR為色氨酸（W）。PDR1基因Kinase-2最后一個氨基酸為天冬氨酸（D），可認(rèn)為是TIR類。本研究獲得的PDR1基因全長是通過生物信息學(xué)方法預(yù)測得到的，而不是通過試驗手段，如RACE。本研究過程中也曾試圖利用RACE技術(shù)獲得全長，然而卻極其困難。同時，NCBI上相似度較高長度在4 500 bp以上的基因，除已經(jīng)完成全基因組測序的苜蓿之外也全是預(yù)測序列，可見，較長序列的全長獲得在世界范圍內(nèi)也是一個難題。PDR1基因全長的獲得需要在接下來的工作中尋找新的方法，逐步獲得。

我國有70%面積的花生受到不同程度的干旱危害，干旱脅迫可以顯著影響花生出苗、生長、開花、產(chǎn)量及品質(zhì)等。篩選花生抗旱重要基因，是通過基因工程技術(shù)培育高產(chǎn)抗逆花生種質(zhì)的基礎(chǔ)。雖然花生基因組測序已經(jīng)取得重要進展，基因組已公布（http：//peanutbase.org/genomes），但尚有大量工作未完成，已公布的數(shù)據(jù)無法直接應(yīng)用，對于許多基因，研究者仍然知之甚少，因此同源基因的功能表達(dá)研究仍是花生逆境脅迫研究工作的重要組成部分。本研究對PDR1在干旱脅迫后不同時間點的表達(dá)情況進行了分析，總體趨勢表現(xiàn)為先上升后下降，最后趨于穩(wěn)定。PDR1是NBS-LRR類抗性基因，可能與花生的抗逆性相關(guān)。從本研究的結(jié)果來看，初始階段，基因表達(dá)量上升，表明PDR1開始應(yīng)答干旱環(huán)境，參與花生抗旱過程，隨后下降并趨于穩(wěn)定，但仍高于初始階段相對表達(dá)量，表明該基因已適應(yīng)干旱環(huán)境，平穩(wěn)表達(dá)。因此推測，PDR1基因的功能可能與花生抗旱性相關(guān)。

本研究為發(fā)現(xiàn)新的NBS-LRR類基因提供了資源，并且為下一步克隆PDR1基因全長、篩選新抗旱花生種質(zhì)提供了理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]萬書波. 花生產(chǎn)業(yè)形勢與對策[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014， 46（10）：128-132.

[2]孫學(xué)武，王才斌. 中國花生對外貿(mào)易概況及前景展望[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 45（11）： 129-133.

[3]孫大容. 花生的抗旱育種[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：256-275.

[4]Wright G C. Alleviation of drought stress and aflatoxin incidence in peanut short maturing varieties [C]//Proceedings of the 9th Australian Agronomy Conference. Australian Society of Agronomy （Inc.），1998.

[5]Li C J， Liu Y， Zheng Y X， et al. Cloning and characterization of an NBS-LRR resistance gene from peanuts （Arachis hypogaea L.） [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2013， 84： 70-75.

[6]劉宇，李春娟，鄭奕雄， 等. 苗期干旱對花生抗病相關(guān)基因PnAG3的表達(dá)及耐旱生理指標(biāo)的影響[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2012，20（6）：642-648.

[7]Meyers B C， Kozik A， Griego A， et al. Genome-wide analysis of NBS-LRR -encoding genes in Arabidopsis [J]. Plant Cell， 2003， 15（4）： 809-834.

[8]曲滿義，查向東，王鈺， 等. 甘薯NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆、分析及數(shù)目研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2008， 29（5）： 610-617.

[9]王世全， 張德春， 李平， 等. 水稻中一個NBS-LRR抗病同源基因家族的克隆和分析[J]. 遺傳學(xué)報， 2005， 32（7）： 704-711.endprint

[10]王巖， 李兆陽， 唐心龍， 等. 擬南芥基因組NBS-LRR類基因家族的生物信息學(xué)分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2009， 25（15）： 40-45.

[11]吳大強， 蔡誠， 魏國， 等. 毛果楊全基因組NBS類型抗病基因分析[J]. 林業(yè)科學(xué)， 2009， 45（2）： 152-157.

[12]楊秀紅， 陳慶山， 楊慶凱， 等. 大豆NBS類抗病相關(guān)基因的克隆與序列分析[J]. 高技術(shù)通訊，2005，15（2）：71-78.

[13]王海燕， 楊文香， 劉大群. 小麥NBS-LRR類抗病基因同源序列的分離與鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39（8）： 1558-1564.

[14]Yuksel B， Estill J C， Schulze S R， et al. Organization and evolution of resistance gene analogs in peanut [J]. Mol. Gen. Genom.， 2005， 274： 248-263.

[15]晏立英，廖伯壽，黃家權(quán)，等. 花生NBS類抗病基因類似物的分離與序列分析[C]//第五屆全國花生學(xué)術(shù)研討會論文集. 2007：244-248.

[16]楊晨， 徐鳳花， 單世華， 等. 花生子葉RNA提取方法比較與分析[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011（1）： 1-5.

[17]Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences [J]. J. Mol. Evol.， 1980， 16： 111-120.

[18]魏芳， 馬鴻翔. 小麥抗赤霉病品種NBS同源序列克隆與分析[J]. 生物技術(shù)通報， 2012（2）： 128-135.

[19]Monosi B， Wisser R J， Pennill L， et al. Full-genome analysis of resistance gene homologues in rice [J]. Theor. Appl. Genet.， 2004，109（7）：1434-1447.

[20]Whitham S， McCormick S， Baker B. The N gene of tobacco confers resistance to tobacco mosaic virus in transgenic tomato [J]. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1996， 93：8776-8781.

[21]Milligan S B， Bodeau J， Yaghoobi J， et al. The root knot nematode resistance gene Mi from tomato is a member of the leucine zipper， nucleotide binding， leucine-rich repeat family of plant genes [J].Plant Cell， 1998， 10：1307-1319.

[22]Meyers B C， Dickerman A W， Michelmore R W， et al. Plant disease resistance genes encode members of an ancient and diverse protein family within the nucleotide-binding superfamily [J].The Plant Journal， 1999， 20（3）： 317-322.endprint