夏文靜　王巖

摘要 胰高血糖素樣肽1為一類(lèi)降血糖多肽藥物。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其結(jié)構(gòu)也一直進(jìn)行著不斷改進(jìn)。從胰高血糖素樣肽1結(jié)構(gòu)改造的總體概況、專(zhuān)利技術(shù)發(fā)展態(tài)勢(shì)、重點(diǎn)申請(qǐng)人和重點(diǎn)專(zhuān)利技術(shù)的角度，詳細(xì)闡述胰高血糖素樣肽1結(jié)構(gòu)改造領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展，有利于胰高血糖素樣肽1相關(guān)領(lǐng)域的藥物研發(fā)、專(zhuān)利申請(qǐng)等，對(duì)今后的相關(guān)科研或生產(chǎn)工作有所幫助。

關(guān)鍵詞 胰高血糖素樣肽1；糖尿?。唤Y(jié)構(gòu)；改造

中圖分類(lèi)號(hào) S-03 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2015）20-012-04

Abstract Glucagon like peptide1（GLP1） is a polypeptide drug which has hypoglycemic effect， and there are many studies on the improvement technology of GLP1. This review introduces the trend of development on glucagon like peptide1 from the perspective about the basic situation of structural modification of glucagon like peptide1， the development of relevant patent technology， the important applicants and the important patent technology， and also elaborates the improvement trend of patent technology on glucagon like peptide1， in order to provide some reference for relevant patent examination and relevant scientific research.

Key words Glucagon like peptide1； Diabetes； Structure； Modification

近年來(lái)，胰高血糖素樣肽1（Glucagonlike peptide1，GLP1）以其獨(dú)特的作用機(jī)制、良好的治療效果已被2 型糖尿病治療領(lǐng)域的科研人員廣泛關(guān)注。GLP1是一種來(lái)自腸道L細(xì)胞加工分泌的多肽類(lèi)激素。1983年Bell等在對(duì)胰高血糖素原（Proglucagon，PG）的基因序列進(jìn)行分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)它可以刺激胰島素分泌而不出現(xiàn)低血糖，因而能夠避免糖尿病治療中常存在的產(chǎn)生低血糖癥的危險(xiǎn)。

完整的GLP1由37個(gè)氨基酸組成，經(jīng)過(guò)兩步酶切，分別去除N端6個(gè)氨基酸即形成C 端酰胺化，最終生成具有高度活性的GLP1（736）酰胺（也稱(chēng)GLP1片段）。在人體血循環(huán)中，GLP1可被二肽酶Ⅳ（Dipeptidyl pepidiase Ⅳ，DPP Ⅳ；CD26）迅速酶解，即特異性識(shí)別GLP1N末端第2位丙氨酸（Ala）殘基，從肽鏈N末端第2位丙氨酸（Ala）處切除二肽，使其由具有生物活性的GLP1（736）酰胺水解成無(wú)活性的GLP1（936）酰胺，并且加上較快的腎臟清除速率，天然的GLP1僅有2～6 min短暫的循環(huán)半衰期，因此需要通過(guò)泵采用持續(xù)的皮下灌流以維持體內(nèi)的GLP1功效。但是，由于GLP1具有其他降糖藥物無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)，如何延長(zhǎng) GLP 1 的血漿半衰期， 同時(shí)保持或增強(qiáng)其生物活性成為各國(guó)科研人員以及制藥公司的研究目標(biāo)[1-2]。

以涉及胰高血糖素樣肽1及其類(lèi)似物結(jié)構(gòu)改造的專(zhuān)利數(shù)據(jù)為分析樣本，筆者從專(zhuān)利申請(qǐng)的地區(qū)分布、時(shí)間分布、申請(qǐng)人狀況、專(zhuān)利技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)等角度詳細(xì)剖析國(guó)內(nèi)外胰高血糖素樣肽1結(jié)構(gòu)改造的專(zhuān)利技術(shù)的發(fā)展?fàn)顩r，并且在此基礎(chǔ)上為國(guó)內(nèi)胰高血糖素樣肽1的發(fā)展提出建議。

1 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)整體概況

根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)收集的文獻(xiàn)量、分布特點(diǎn)，對(duì)中文和外文數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行選擇，其中中文數(shù)據(jù)庫(kù)選擇CNTXT數(shù)據(jù)庫(kù)。CNTXT數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了1985 年至今在中國(guó)申請(qǐng)的全部專(zhuān)利文獻(xiàn)。通過(guò)數(shù)據(jù)提取，將中國(guó)專(zhuān)利代碼化數(shù)據(jù)中的說(shuō)明書(shū)及權(quán)利要求這兩個(gè)部分的信息提取出來(lái)，形成中國(guó)專(zhuān)利全文文本代碼化數(shù)據(jù)庫(kù)?？紤]到GLP1結(jié)構(gòu)改造后半衰期延長(zhǎng)或具備長(zhǎng)效性等類(lèi)似的描述屬于技術(shù)效果的描述，未必被歸為專(zhuān)利申請(qǐng)的發(fā)明點(diǎn)而出現(xiàn)在權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)摘要中，而是僅作為有益效果出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)中，筆者選擇CNTXT作為中文數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索涉及的關(guān)鍵詞主要為胰高血糖素樣肽1、GLP1、長(zhǎng)效、半衰期、延長(zhǎng)、變長(zhǎng)、更長(zhǎng)、增長(zhǎng)等。檢索涉及的國(guó)際專(zhuān)利分類(lèi)號(hào)主要為C07K14/605以及A61K38/26，輔之C07K、C12N、A61K、A61P等。由于檢索所使用關(guān)鍵詞還涉及胰高血糖素樣肽激動(dòng)劑等技術(shù)，因而在檢索時(shí)還通過(guò)排除激動(dòng)劑等關(guān)鍵詞以剔除由所產(chǎn)生的干擾[3]。

1.1 地區(qū)分布

由圖1可知，國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人的申請(qǐng)量為58件， 占總申請(qǐng)量的58%；國(guó)外申請(qǐng)人的申請(qǐng)量為42件，占總申請(qǐng)量的42%，其中美國(guó)14件，丹麥12件，這兩個(gè)國(guó)家申請(qǐng)人的申請(qǐng)量合計(jì)占國(guó)外申請(qǐng)人總申請(qǐng)量的67%，可見(jiàn)美國(guó)、丹麥的申請(qǐng)人構(gòu)成該領(lǐng)域?qū)＠暾?qǐng)的主體。

1.2 申請(qǐng)人概況

表1列出了GLP1領(lǐng)域?qū)＠暾?qǐng)量排名前四位的國(guó)內(nèi)申請(qǐng)人，即中國(guó)藥科大學(xué)、華東師范大學(xué)、暨南大學(xué)和天津藥物研究院。同時(shí)，依托上述科研院所的研究技術(shù)，上述高校所在地區(qū)的中小型藥企的專(zhuān)利申請(qǐng)相對(duì)于其他地區(qū)較多，如上海、杭州、天津、深圳等地。

表2列出了GLP1領(lǐng)域?qū)＠暾?qǐng)量排名前五位的國(guó)外申請(qǐng)人。國(guó)外申請(qǐng)人的專(zhuān)利申請(qǐng)一般發(fā)生于該領(lǐng)域的早中期，對(duì)于GLP1的結(jié)構(gòu)改造的研究起不可或缺的作用。以丹麥的諾沃挪第克公司、諾和諾德公司，美國(guó)的伊萊利利公司以及后期英國(guó)的葛蘭素史克等大型制藥公司的專(zhuān)利申請(qǐng)為基礎(chǔ)，國(guó)內(nèi)高校和公司才逐漸開(kāi)展該領(lǐng)域的研究改造工作。

2 技術(shù)發(fā)展脈絡(luò)

體外化學(xué)修飾技術(shù)是在多肽水平上，使用合適的修飾方法和修飾劑對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾，使得修飾后的多肽類(lèi)藥物在體內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)。目前，國(guó)內(nèi)外研究者主要從兩個(gè)方面著手進(jìn)行 GLP1 的結(jié)構(gòu)改造研究（圖2）。一是對(duì)抗 DPPIV的水解， 主要有GLP1肽鏈中氨基端的修飾或替換、GLP1肽鏈 C端的延伸、環(huán)化、糖鏈修飾等；另一方面是延緩 GLP1的腎臟消除速率， 以此為出發(fā)點(diǎn)進(jìn)行的結(jié)構(gòu)改造有聚乙二醇修飾、與大分子蛋白結(jié)合、脂肪酸修飾、香豆素修飾以及形成二聚體結(jié)構(gòu)等。

2.1 GLP1肽鏈中氨基端的修飾、替換或延伸

最早GLP1肽鏈中氨基端替換的研究始于1990年公開(kāi)號(hào)為JPH05506427 A的文件。在接下來(lái)的數(shù)十年間，國(guó)外的幾大公司一直致力于該領(lǐng)域的研究。1995年，美國(guó)的伊萊利利公司制備了GLP1類(lèi)似物包括氨基酸替換、氨基或羧基端的修飾、C6C10的?；又?996～1997年丹麥的諾沃挪第克公開(kāi)了通過(guò)在肽的N末端進(jìn)行修飾，使GLP1肽類(lèi)似物能夠抵抗DPPIV的降解，延長(zhǎng)GLP1肽半衰期的一個(gè)備選方法是衍生化作用，其中將阻止DPPIV 接近肽N末端的大的酰基以及親脂性取代基連接在GLP1的多種氨基酸上。1999年，加拿大的康久化學(xué)公司提出一種經(jīng)修飾的促胰島素活化衍生物，含有與血液中的氨基、羥基或巰基反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的反應(yīng)性基團(tuán)。該基團(tuán)選自琥珀西安亞氨基和馬來(lái)酰亞胺基，使得該衍生物與血液蛋白上的巰基反應(yīng)。2001年，美國(guó)的伊萊利利公司研發(fā)了延伸的C末端偶聯(lián)的多個(gè)位點(diǎn)上具有修飾的GLP1肽，所述修飾提供了增強(qiáng)的穩(wěn)定性，且其與人白蛋白形成融合蛋白。在接下來(lái)一年，該公司又對(duì)延伸的C末端偶聯(lián)的多個(gè)位點(diǎn)上具有修飾的GLP1肽進(jìn)行進(jìn)一步的改造，以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。同年，日本株式會(huì)社三和化學(xué)研究所設(shè)計(jì)了一種GLP1衍生物。它可以通過(guò)用絲氨酸取代GLP1氨基酸序列的8位而具有對(duì)二肽酶IV抗性，或者分別通過(guò)用谷氨酰胺和天冬酰胺取代26位和34位的氨基端而對(duì)胰蛋白酶具有抗性。2004年，丹麥的諾沃挪第克公司將GLP1共價(jià)連接于雜環(huán)羧基生物等以增加分子的血漿半衰期。2005年至今，該領(lǐng)域的專(zhuān)利申請(qǐng)數(shù)量開(kāi)始增加。2005年，該領(lǐng)域的專(zhuān)利申請(qǐng)還以國(guó)外公司為主，國(guó)內(nèi)的暨南大學(xué)、東北師范大學(xué)開(kāi)始該方面的研究。暨南大學(xué)對(duì)5、6、8、34、35和5、6、34、35、37位進(jìn)行修飾，得到半衰期延長(zhǎng)的GLP1類(lèi)似物，而東北師范大學(xué)則將GLP1與人胰高血糖素受體或胰高血糖素家族中任何多肽受體及人免疫球蛋白Fc部分、免疫球蛋白Fc部分片段融合。在國(guó)外方面，丹麥的諾和諾德在2篇專(zhuān)利中分別提供了一類(lèi)GLP1類(lèi)似物，在7、8位上具有至少一種非蛋白質(zhì)源性氨基酸殘基修飾，26或37、38位賴(lài)氨酸殘基處用部分進(jìn)行酰化，且其中所述的部分包含至少2個(gè)酸性基團(tuán)，其中一個(gè)酸性基團(tuán)在末端連接。生物相容英國(guó)公司和美國(guó)的塔夫茨大學(xué)信托人也基于GLP1的肽鏈這氨基端替換或修飾進(jìn)行深入的研究。在2006～2008年，國(guó)內(nèi)研究還是延續(xù)之前構(gòu)思，如華東師范大學(xué)在37位后添加2～3個(gè)特定種類(lèi)的氨基酸，大連帝恩生物工程有限公司將酶解關(guān)鍵性位點(diǎn)突變?cè)倥c人白蛋白相連，而美國(guó)的白時(shí)美施貴寶公司、丹麥的諾沃挪第克則對(duì)GLP1的N端進(jìn)行復(fù)雜的化學(xué)修飾以具備二肽肽酶IV抗性。2008年，中國(guó)藥科大學(xué)加入到GLP1類(lèi)似物改造的隊(duì)伍中。他們于8、9、16、22、27或37位點(diǎn)進(jìn)行改造得到具有更長(zhǎng)藥理作用時(shí)間的GLP1類(lèi)似物。丹麥的西蘭制藥公司均對(duì)GLP1的N端、C端以及特定位點(diǎn)進(jìn)行改造，以期具有長(zhǎng)效性。2009年，華東師范大學(xué)大力進(jìn)行該領(lǐng)域的研究，提出4篇申請(qǐng)，主要涉及特定位點(diǎn)的改造，而國(guó)內(nèi)中小型藥企也開(kāi)始仿制藥的研發(fā)，主要涉及相關(guān)位點(diǎn)的氨基酸種類(lèi)替換，在這一年值得一提的是申請(qǐng)人南開(kāi)大學(xué)。它不僅如前將涉及相關(guān)位點(diǎn)的氨基酸種類(lèi)替換，而且將GLP1基因串聯(lián)表達(dá)，達(dá)到穩(wěn)定、長(zhǎng)效的生理效果。2010～2013年，該領(lǐng)域的專(zhuān)利申請(qǐng)達(dá)20件之多，其中多數(shù)是國(guó)內(nèi)高校和中小型藥企，研究的方向多是通過(guò)氨基端種類(lèi)的替換以達(dá)到增加體內(nèi)半衰期的目的。

2.2 環(huán)化

在多數(shù)情況下，機(jī)體內(nèi)的氨肽酶及羧肽酶很容易從常見(jiàn)的直鏈肽的兩端進(jìn)行逐步地切割分解，使得直鏈肽被降解。 因此，對(duì)肽鏈進(jìn)行環(huán)化結(jié)構(gòu)改造，可以提高多肽類(lèi)藥物在機(jī)體內(nèi)的生物穩(wěn)定性，延長(zhǎng)半衰期 。按照橋頭環(huán)化位置，可將環(huán)肽分為 C端與N端相連、 側(cè)鏈間相連、N端與 側(cè)鏈相連、C端與側(cè)鏈相連以及主鏈上的 NN相連5類(lèi)。2011年，國(guó)內(nèi)的兩家制藥公司研發(fā)了環(huán)化的GLP1分子。其中杭州中肽生化有限公司設(shè)計(jì)的環(huán)化GLP1為N端與側(cè)鏈相連且側(cè)鏈間相連的環(huán)化多肽，而天津拓飛生物科技有限公司開(kāi)發(fā)的為C端與N端相連的環(huán)化GLP1。上述化合物有效地延長(zhǎng)了藥效時(shí)間。

2.3 聚乙二醇修飾

聚乙二醇 （Polyethy lene glycol ，PEG ）修飾又稱(chēng)分子的 PEG化。 GLP1經(jīng) PEG化后相對(duì)分子質(zhì)量增大，腎小球?yàn)V過(guò)作用減慢，血漿半衰期延長(zhǎng)。GLP1分子中有His7、Lys26和 Lys343個(gè)位點(diǎn)可進(jìn)行 PEG修飾。目前應(yīng)用最普遍的PEG修飾劑是單甲氧基聚醇（mPEG）。當(dāng)PEG修飾多肽類(lèi)藥物時(shí)，為了使PEG能在較溫和的反應(yīng)條件下與多肽偶聯(lián)，需先將PEG活化， 再將活化后的 PEG與多肽肽鏈的 C端、N端以及側(cè)鏈上的氨基、巰基和羧基進(jìn)行偶聯(lián)。

該方面申請(qǐng)最早于2003年，專(zhuān)利CN1832959A提供了偶聯(lián)有至少一個(gè)聚乙二醇分子或其衍生物的GLP1化合物，其中每個(gè)PEG連在肽的Cys或Lys氨基酸或羧基末端上，導(dǎo)致產(chǎn)生與其非PEG化肽相比半衰期延長(zhǎng)和清除率減慢的生物活性肽。這些PEG化GLP1化合物和組合物可用于治療能夠通過(guò)降低血液葡萄糖、抑制胃和/或腸蠕動(dòng)和胃和/或腸排空或抑制食物攝取而受益的糖尿病、肥胖癥、過(guò)敏性結(jié)腸綜合征和其他疾病。在隨后的2004～2013年間，聚乙二醇修飾的GLP1一直是研究的熱點(diǎn)。國(guó)內(nèi)最早研究聚乙二醇化GLP1的專(zhuān)利申請(qǐng)CN1676163始于2004年，申請(qǐng)人為華東師范大學(xué)。該專(zhuān)利提出，將GLP1與含經(jīng)過(guò)琥珀酰亞胺活化的活性基團(tuán)的單甲氧基聚乙二醇組成復(fù)合物——單甲氧基聚乙二醇-丙琥珀酰亞胺，即mPEGSPA或分枝狀單甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亞胺，即mPEGNHS組成，兩者通過(guò)前者的氨基酸游離氨基和后者的琥珀酰亞胺酯鍵形成的酰胺鍵連接在一起。所述的單甲氧基聚乙二醇分子量為5～40 kD。接著，2005年美國(guó)的伊萊利利公司也提出GLP1聚乙二醇化的技術(shù)方案，它制備了與2個(gè)聚乙二醇分子偶聯(lián)的GLP1化合物或其衍生物，產(chǎn)生與未聚乙二醇化的肽相比具有延長(zhǎng)半衰期和降低清除率的生物活性肽。在2008年后，國(guó)內(nèi)制藥公司開(kāi)始加入聚乙二醇化GLP1研究的隊(duì)伍，如揚(yáng)子江藥業(yè)、派格生物醫(yī)藥、江蘇豪森藥業(yè)等，而中國(guó)藥科大學(xué)、華東師范大學(xué)等長(zhǎng)期研究GLP1結(jié)構(gòu)改造的高校也對(duì)聚乙二醇化GLP1做出相關(guān)研究。值得一提的是江蘇豪森藥業(yè)研制的分枝型PEG修飾的GLP1類(lèi)似物，指出目前修飾用的PEG有兩分枝型、四分枝型等多種結(jié)構(gòu)。分枝型PEG的接頭也有多種，如甘油接頭、賴(lài)氨酸接頭等。對(duì)于每種具體結(jié)構(gòu)的生物肽，哪種PEG修飾方式最佳并不固定，而研究發(fā)現(xiàn)兩分枝的PEG在修飾該發(fā)明肽鏈上具有突出優(yōu)勢(shì)。所述分枝型PEG分子量?jī)?yōu)選40 kD或60 kD，分枝型PEG的接頭優(yōu)選賴(lài)氨酸（Lys）。

盡管PEG化聚乙二醇有諸多優(yōu)勢(shì)，但PEG修飾劑本身的分散性造成修飾后的藥物具有一定的分散性。 這會(huì)直接影響產(chǎn)品的生物相容性、 化學(xué)性能以及臨床功效等。 這也是目前困擾 PEG修飾的一大難點(diǎn)。

2.4 與大分子蛋白結(jié)合

在目前的許多方法中，把一個(gè)生物活性蛋白（這個(gè)蛋白在給藥以后易被清除）和一個(gè)血漿蛋白（這個(gè)蛋白是自然存在的，具有低的清除率）偶聯(lián)在一起，是一種有前景的提高生物活性肽半衰期的策略（Sheffield WP，Cardiovacs Haematol Disord 1，15，2001）。這種融合蛋白臨床應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)是能夠減少藥物注射的頻率，提高藥物在體內(nèi)的濃度。一些病原體為免遭排斥而進(jìn)化獲得特異性地結(jié)合到免疫球蛋白、白蛋白、纖維結(jié)合蛋白或纖維蛋白素原等循環(huán)的蛋白質(zhì)衍生物分子。以上策略與這種病原體的策略相似。

人血清白蛋白（HAS）是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，濃度約為600 μmol/L，占血漿總蛋白的40%～60%。它也是人體血漿中主要的藥物運(yùn)輸?shù)鞍?，在人體內(nèi)的半衰期可達(dá)19 d。與人血清白蛋白結(jié)合能有效地改善某些肽分子和蛋白藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，延長(zhǎng)其半衰期。因此，將GLP1與血清白蛋白親和結(jié)合序列融合。該融合蛋白與血清白蛋白親和結(jié)合，可以達(dá)到緩釋的目的，并且不易被腎臟清除，從而延長(zhǎng)GLP1血漿半衰期。

早在2000年，一直致力于GLP1結(jié)構(gòu)改造的美國(guó)伊萊利利公司提出將GLP1與人白蛋白融合。接著，在2003年，丹麥的諾沃挪第克公司繼其1999年脂肪酸修飾GLP研究后也開(kāi)始此方面研究，也是將GLP1類(lèi)似物與白蛋白連接。從2006年開(kāi)始，該領(lǐng)域成為GLP結(jié)構(gòu)改造的研究熱點(diǎn)，涌現(xiàn)出一批專(zhuān)利申請(qǐng)。2006年的GLP與大分子蛋白結(jié)合的研究還是集中在GLP1與血清白蛋白結(jié)合方面。2007年韓國(guó)韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社首先提出將GLP1與免疫球蛋白Fc區(qū)域相連。在此之前，國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)第WO02/46227號(hào)申請(qǐng)，描述了使用基因重組技術(shù)通過(guò)將GLP1、exendin4或其類(lèi)似物與人血清白蛋白或免疫球蛋白區(qū)（Fc）結(jié)合來(lái)制備融合蛋白。美國(guó)專(zhuān)利第6、756、480號(hào)描述了通過(guò)將甲狀旁腺激素（PTH）和其類(lèi)似物與Fc區(qū)結(jié)合來(lái)制備Fc融合蛋白。這些方法可以解決如聚乙二醇化產(chǎn)量低和非特異性的問(wèn)題，但是它們?nèi)跃哂羞@樣一個(gè)問(wèn)題，即增加血液中半衰期的效果不像期待中的那么顯著，并且有時(shí)濃度也很低。為了使增加血液中半衰期的效果最大化，使用各種類(lèi)型的肽連結(jié)器，但是可能引起免疫反應(yīng)。 在上述韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社的專(zhuān)利申請(qǐng)CN 101646451中，發(fā)明人將免疫球蛋白Fc和非肽聚合物與非N末端的氨基酸殘基處通過(guò)共價(jià)鍵連接到促胰島素肽的特異性位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)綴合物具有顯著地增加體內(nèi)功效和半衰期的用途。到2008年，國(guó)內(nèi)才出現(xiàn)關(guān)于此領(lǐng)域的專(zhuān)利申請(qǐng)。申請(qǐng)?zhí)枮?00810028614.5、名稱(chēng)為“一種緩釋生物活性多肽的方法與應(yīng)用”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N融合多肽，其中的血清白蛋白結(jié)合肽可為L(zhǎng)PHSHRAHSLPP，連接體為FNPRGA、FNPRGS、FNPRGP、FNPRPP、FNPRPA，其可以于人血清白蛋白（HAS），從而延長(zhǎng)其半衰期。2009年，葛蘭素史克的專(zhuān)利WO2011039096以及丹麥的諾沃挪第克公司依然是將GLP1結(jié)合于白蛋白上，但是它們均對(duì)GLP1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，使得相應(yīng)的半衰期延長(zhǎng)。2010年，專(zhuān)利CN102533655（申請(qǐng)人青島黃海制藥有限責(zé)任公司）雖然研究的仍是GLP/Fc，但是公開(kāi)了一種高效表達(dá)人源GLP/Fc的CHOS細(xì)胞株。一直致力于該領(lǐng)域研究的天津藥物研究院則提出了一種融合蛋白，即GLP1連接肽GLP1連接肽GLP1連接肽人源蛋白連接肽GLP1連接肽GLP1連接肽GLP1（I），其中連接肽為GGGGS，人源蛋白選自HSA或IgG的Fc片段。2011年，申請(qǐng)人韓美藥品工業(yè)株式會(huì)社在之前研究的基礎(chǔ)上，為了克服體重增加、惡心和嘔吐的問(wèn)題，嘗試進(jìn)行長(zhǎng)效exendin4綴合物和長(zhǎng)效GLP1綴合物的同時(shí)施用，同時(shí)刺激胰高血糖素樣肽1受體和胰島素受體。結(jié)果表明，上述藥物同時(shí)施用改善了體內(nèi)功效持續(xù)時(shí)間和穩(wěn)定性，并且顯著減小了藥物的劑量，產(chǎn)生了穩(wěn)定的血糖水平。另外，他們還發(fā)現(xiàn)它改善了由胰高血糖素樣肽1激動(dòng)劑和exendin4或其衍生物誘發(fā)的不良事件諸如嘔吐和惡心，并且使用長(zhǎng)效exendin4綴合物減少了由使用胰島素所導(dǎo)致的體重增加。 2012年，中國(guó)藥科大學(xué)的黃文龍?zhí)岢?篇關(guān)于GLP1修飾的申請(qǐng)，修飾后的GLP1類(lèi)似物通過(guò)引入小分子基團(tuán)，增加肽鏈與血清白蛋白的結(jié)合，避免了GLP1的腎臟快速濾過(guò)和代謝失活，從而顯著延長(zhǎng)半衰期及體內(nèi)降糖作用時(shí)間。同年，申請(qǐng)?zhí)枮?00810028614.5的發(fā)明人暨南大學(xué)的李弘劍提出前次專(zhuān)利所提供的GLP1融合多肽在糖尿病動(dòng)物模型db/db小鼠中的降糖試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其降糖效果仍有提高的空間，因而對(duì)連接體進(jìn)行改造，從而將其半衰期延長(zhǎng)3倍。

2.5 脂肪酸修飾

用脂肪酸修飾 GLP1，可促進(jìn)其與血漿蛋白 （如清蛋白）結(jié)合，延緩腎小球?qū)?GLP1的濾過(guò)作用， 從而延長(zhǎng)血漿半衰期。脂肪酸修飾GLP1的技術(shù)始于GLP1結(jié)構(gòu)改造的早期。1999年丹麥的諾沃挪第克公司的WO9808871A1專(zhuān)利便開(kāi)始該方面的研究，制備一種GLP1衍生物，其中母體肽的至少一個(gè)氨基酸殘基連接有一個(gè)親脂性取代基，并且如果只有一個(gè)親脂性取代基，而該取代基又連接到母體肽的N末端或C末端氨基酸殘基上，那么該取代基是烷基或具有一個(gè)ω羧基的基團(tuán)。這些衍生物具有比GLP1（737）更長(zhǎng)時(shí)間的作用曲線和更低的清除率。而丹麥諾和諾德公司開(kāi)發(fā)的Liraglutide（中文名為利拉魯肽）將 GLP1的 Lys34替換成 Arg34， 并在Lys26殘基上連接 16碳?；?，從而在保留 GLP1活性的同時(shí)克服了其易降解的缺點(diǎn)。Liraglutide的半衰期為 11～15 h，僅需每日口服一次就能起到良好的降糖效果。

2.6 香豆素修飾

天然產(chǎn)物中的4羥基香豆素類(lèi)化合物有較強(qiáng)的血清蛋白結(jié)合率。血清白蛋白結(jié)合以后的藥物與游離藥物在體內(nèi)產(chǎn)生平衡，緩慢釋放，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效化。同時(shí)，血清白蛋白結(jié)合藥物不被腎小球?yàn)V過(guò)，可以避免腎臟的濾過(guò)代謝。依據(jù)上述構(gòu)思，2011年中國(guó)藥科大學(xué)黃文龍等將4羥基香豆素為母核的香豆素類(lèi)化合物，通過(guò)半胱氨酸的巰基與GLP肽鏈相連接，并對(duì)肽鏈中相關(guān)氨基端修飾，從而制備了一種胰高血糖素樣肽1（GLP1）類(lèi)似物。它在保留降糖活性的基礎(chǔ)上，具有抗腎臟濾過(guò)消除和抗DPPIV酶解作用，生物半率期較GLP1原型長(zhǎng)，提高GLP1的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)作用時(shí)間。

2.7 糖鏈修飾

與未聚乙二醇化（unPEGylated）肽相比，經(jīng)過(guò)聚乙二醇修飾可得到半衰期延長(zhǎng)、清除延遲化的的GLP1。但是，PEG為在生物體內(nèi)不代謝的化合物，因此在持續(xù)給藥聚乙二醇化GLP1化合物時(shí)，存在PEG蓄積在生物體內(nèi)、對(duì)生物體產(chǎn)生藥害的危險(xiǎn)性。糖鏈在生物體內(nèi)擔(dān)負(fù)著多種重要生理功能。雖然研究者已意識(shí)到其重要性，但因其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、多樣性而導(dǎo)致研究比較落后。多肽藥物的糖基化修飾可以增加側(cè)鏈的空間位阻， 提高多肽對(duì)酶的穩(wěn)定性，如LY2189265是一種新型的長(zhǎng)效胰高血糖素（GLP1） 受體拮抗劑， 用于治療 Ⅱ型糖尿病。通過(guò)糖基化修飾， 該藥物只需每周注射 1次， 大大提高了病人的依從性。

而在專(zhuān)利研究方面，日本株式會(huì)社糖鎖工學(xué)研究所的梶原康宏等于2007～2009年的3篇專(zhuān)利均涉及GLP1的糖鏈修飾。與GLP1相比，附加糖鏈的GLP1肽血中半衰期長(zhǎng)，且優(yōu)選顯示高的血糖值抑制活性。上述附加糖鏈的GLP1肽的特征在于在（a）GLP1、（b）GLP1中缺失、取代或附加1或數(shù)個(gè)氨基酸的肽或在（c）GLP1的類(lèi)似物中至少1個(gè)氨基酸被附加糖鏈的氨基酸取代，一般為附加糖鏈的Asn或附加糖鏈的Cys，其中糖鏈和氨基酸可以通過(guò)接頭結(jié)合，也可以不通過(guò)接頭結(jié)合。糖鏈一般優(yōu)選為由4個(gè)以上糖構(gòu)成的糖鏈。種類(lèi)選自二唾液酸糖鏈、單唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、二N乙酰葡萄糖胺糖鏈及二甘露糖糖鏈的糖鏈等。

2.8 形成二聚體結(jié)構(gòu)

為抵抗二肽酶IV對(duì)GLP1的降解，延長(zhǎng)在體內(nèi)的藥效時(shí)間，已有多種方法，如上述氨基酸的定點(diǎn)突變、分子修飾等，但是改造后的分子與天然GLP1的同源率低，差異較大，導(dǎo)致不同程度的副作用如過(guò)敏、嘔吐、胃腸不適等。 2011年，華東師范大學(xué)勞勛等提出如下對(duì)GLP1的改進(jìn)：在GLP1衍生物DLG3312的結(jié)構(gòu)XYX中，X與Y的連接方式為2個(gè)X的碳端羧基分別與Y的2個(gè)氨基縮合連接，其中，X表示的序列為HX8EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG，其中X8是A、G、dA或V中的任意一個(gè)，dA表示DAla；Y表示二氨基羧酸，包括Lys、Orn。所述GLP1衍生物DLG3312通過(guò)所述X的碳端羧基與所述Y的氨基縮合連接成同源二聚體，由此形成由2個(gè)X與1個(gè)Y構(gòu)成的特定結(jié)構(gòu)的U型同源二聚體。它具有如下優(yōu)點(diǎn)：與受體的親和力相對(duì)于單體有較大提高，從而能夠更有效地激活受體；與單體相比，二聚體具有相對(duì)較大的分子量，由此相對(duì)延長(zhǎng)因腎小球?yàn)V過(guò)作用對(duì)其清除的時(shí)間，使之在體內(nèi)停留時(shí)間增加，延長(zhǎng)藥效時(shí)間等。 另外，專(zhuān)利CN103059127、CN103059127也涉及形成二聚體結(jié)構(gòu)GLP1。二聚體的形成在某些程度上極大地延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的半衰期。在某些程度上極大地延長(zhǎng)了其在體內(nèi)的半衰期。

3 展望

雖然目前對(duì)GLP 1 及其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)改造研究已取得良好的效果，但也要看到不足之處，如多數(shù)藥物仍存在不良反應(yīng)，最常見(jiàn)的是胃腸道反應(yīng)即惡心、嘔吐，艾賽那肽（Exenatide）還可能導(dǎo)致部分患者出現(xiàn)急性胰腺炎。將化學(xué)與生物方法相結(jié)合應(yīng)用于多肽藥物長(zhǎng)效化技術(shù)的探索，集兩者的優(yōu)勢(shì)，共同開(kāi)發(fā)新型的復(fù)合型長(zhǎng)效化GLP1是將來(lái)的趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[1]孫靈芝，阮學(xué)平，阿麗塔.胰高血糖素樣肽- 1及其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)改造研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2010，39（7）：17-19.

[2] 姜和，龔夢(mèng)嘉.長(zhǎng)效多肽藥物化學(xué)修飾的研究進(jìn)展[J].重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2012，26（4）：33-39.

[3] 馮剛.聚苯醚產(chǎn)業(yè)中國(guó)專(zhuān)利分析[J].塑料工業(yè)，2010，38（9）：1-5.