孫董董 林春花 李博勛 黃貴修

摘 要 P型ATP酶是一類可以被ATP驅(qū)動其發(fā)生磷酸化的陽離子泵。利用TCDB（Transporter Classification Database）網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫中的P型ATP酶氨基酸序列對3種炭疽菌（禾谷炭疽、希金斯炭疽、膠孢炭疽）全基因組數(shù)據(jù)庫進行搜索，結(jié)合結(jié)構(gòu)域分析和進化樹聚類分析，共找出候選P型ATP酶基因禾谷炭疽菌26個，希金斯炭疽菌37個，膠孢炭疽菌29個。對這些候選基因進行基因功能預測發(fā)現(xiàn)其主要參與轉(zhuǎn)運Na+/K+、Ca2+、重金屬離子以及磷脂的功能。利用MEME程序分析，從3種炭疽菌中均鑒定獲得20個基序，其中有6個基序相同。這為深入研究炭疽菌P型ATP酶家族基因生物學功能奠定了基礎。

關鍵詞 炭疽菌；P型ATP酶基因；生物信息；功能預測

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

炭疽菌（Colletotrichum spp.）是一類重要的植物病原真菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)[1]，其種內(nèi)變異較多，寄主范圍廣泛，包括蔬菜、牧草、果樹、花卉等數(shù)十種重要的經(jīng)濟作物[2]。炭疽菌主要出現(xiàn)在春季和初夏， 侵害木本植物的葉、花、枝、果實，其主要以分生孢子侵染， 分生孢子依靠雨水傳播， 或者通過昆蟲傳播[3]。目前，炭疽菌已經(jīng)成為研究病原真菌生長發(fā)育、侵染過程、信號轉(zhuǎn)導及植物-病原菌互作機理的典型材料[4]。

ATP酶是一類能夠水解ATP產(chǎn)生能量，使生物體內(nèi)的各種陽離子能夠逆電化學梯度進行跨膜轉(zhuǎn)運的膜蛋白[5]。植物體內(nèi)的ATP酶主要有3類，分別是位于質(zhì)膜上的P型ATP酶；液泡膜上的V 型ATP酶以及與H+跨膜轉(zhuǎn)運相耦聯(lián)的F型ATP 酶[5]。P型ATP酶是一類可以被ATP驅(qū)動其發(fā)生磷酸化的陽離子泵，普遍存在于各種生物中，參與生物體許多重要的代謝過程，涉及膜電位的產(chǎn)生、肌肉收縮及去除細胞內(nèi)有毒離子（Cu+、Ag+、Zn2+、Cd2+、或Pb2+）。在植物體內(nèi)的物質(zhì)運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導和細胞膜穩(wěn)定性等方面具有重要作用[4]。在植物病原真菌中，P型ATP酶家族基因除了參與離子運輸、細胞信號轉(zhuǎn)導等功能外，部分P型ATP酶還與病菌的生長發(fā)育和致病作用相關，Martin等[6-7]發(fā)現(xiàn)稻瘟病菌中的ATP酶基因MgAPT2和PDE1與病原菌的致病性密切相關，其中MgAPT2是稻瘟病菌侵染過程中分泌作用所必須的，該基因的突變導致多種胞外酶的分泌受阻，形成大量不正常的高爾基體類的囊泡，進而影響附著胞的形成[6]；PDE1是調(diào)節(jié)稻瘟病菌穿透菌絲的發(fā)育和致病作用[8]；蔡志英[9]克隆了橡膠樹膠孢炭疽菌CgATPase基因，并利用基因敲除與互補技術(shù)對其進行分析，證實了CgATPase基因是橡膠樹膠孢炭疽菌的一個致病基因，該基因不僅影響菌株穿透橡膠樹葉片表皮組織的能力，還可調(diào)控菌株生長速度、產(chǎn)孢量、菌落形態(tài)、孢子大小和維持細胞的完整性。

由炭疽菌侵染引起的植物病害十分普遍且危害嚴重，生產(chǎn)上很難控制該病菌的發(fā)生和流行。為了更好的獲得防治炭疽菌的作用靶標，尋找新的致病關鍵因子，了解炭疽菌致病相關基因的基礎信息，本項目組在前期研究工作中，在橡膠樹膠孢炭疽菌中克隆得到了一個P型ATP酶基因CgATPase[9]，經(jīng)功能驗證發(fā)現(xiàn)該基因與橡膠樹膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）的致病性密切相關。為了更好的了解炭疽菌中P型ATP酶家族的基本信息，本研究采用生物信息學的方法對已經(jīng)全基因組測序的希金斯炭疽菌（C. higginsianum）（CACQ01000000）、禾谷炭疽菌（C. graminicola）（ACOD01000000）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）中P型ATP酶基因家族數(shù)量、基因結(jié)構(gòu)、保守基序和種類進行分析，并對膠孢炭疽菌中的P型ATP酶基因的結(jié)構(gòu)特征和功能進行預測，以期為膠孢炭疽菌中該基因家族的進一步深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

希金斯炭疽菌（C. higginsianum）（CACQ01000000）、禾谷炭疽菌（C. graminicola）（ACOD01000000）和膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）全基因組數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 3種炭疽菌中P型ATP酶基因的種類和鑒定 從網(wǎng)站（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/colletotrichum_group/MultiHome.html）下載禾谷炭疽菌和希金斯炭疽菌全基因組核苷酸序列和氨基酸序列數(shù)據(jù)，和本實驗室全基因組已經(jīng)測序完成的橡膠樹膠孢炭疽菌，構(gòu)建3種炭疽菌基因組本地數(shù)據(jù)庫。從TCDB（Transporter Classification Database）[10]下載炭疽菌中所有的P型ATP酶基因的氨基酸序列，在上述3個炭疽菌全基因組數(shù)據(jù)庫中進行tblastn，獲得禾谷炭疽菌和希金斯炭疽菌所有候選P型ATP酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列，并獲得膠孢炭疽菌的核苷酸序列。把橡膠樹膠孢炭疽菌中獲得的候選P型ATP酶基因的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行ORF（Open Reading Frame）預測，得到膠孢炭疽菌P型ATP酶基因的氨基酸序列，通過NCBI數(shù)據(jù)庫中的blastp對其功能進行預測。

1.2.2 P型ATP酶基因功能結(jié)構(gòu)域分析 利用在線的簡單模塊構(gòu)架搜索工具（simple modular architecture research tool， SMART； http： //smart.embl-heielberg.de/smart/set_mode.cgi）， 對上述獲得的P型ATP酶進行結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.3 3種炭疽菌中P型ATP酶基因的聚類分析 用MEGA5.0軟件對禾谷炭疽菌、希金斯炭疽菌和膠孢炭疽菌中的候選P型ATP酶基因的氨基酸序列進行比對，采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000次重抽樣評估（其它參數(shù)為默認值）。

1.2.4 P型ATP酶基因蛋白基序分析 利用MEME 程序（http： //meme.sdsc.edu /meme /meme.html）分析3種炭疽菌中所有P型ATP酶蛋白結(jié)構(gòu)域的基序，設置參數(shù)為： 基序數(shù)目≤20，長度控制在6～200個氨基酸殘基。

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽菌中P型ATP酶候選基因的獲得

從TCDB數(shù)據(jù)庫共下載210條已知P型ATP酶的氨基酸序列，通過對膠孢炭疽菌、希金斯炭疽菌和禾谷炭疽菌全基因組數(shù)據(jù)庫進行tblastn搜索（E-Value≤1e-5），從膠孢炭疽菌數(shù)據(jù)庫中共獲得29條P型ATP酶候選基因，希金斯炭疽菌中共獲得38條P型ATP酶候選基因，禾谷炭疽菌中共獲得26條P型ATP酶候選基因（表1）。膠孢炭疽菌中的P型ATP酶基因編碼蛋白氨基酸平均數(shù)目為831.3，其中最大的含有1 367個氨基酸（Cg 27），最小的含有301個氨基酸（Cg 15）（表1）；禾谷炭疽中的P型ATP酶基因編碼蛋白氨基酸平均數(shù)目為1 200.0，其中最大的含有1 580個氨基酸（GLRG_04841），最小的含有923個氨基酸（GLRG_08118）；希金斯炭疽菌中的P型ATP酶基因編碼蛋白氨基酸平均數(shù)目為924.0，其中最大的含有1 425個氨基酸（CHO63_02178），最小的含有135個氨基（CH063_03065）。

2.2 P型ATP酶候選基因結(jié)構(gòu)域分析及功能預測

采用Blast和SMART軟件對以上候選基因進行結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果顯示，除了Cg 24外，2種軟件預測結(jié)果基本一致。Cg 24用Blast分析預測為陽離子轉(zhuǎn)運P型ATP酶，經(jīng)SMART分析Cg 24含有重金屬結(jié)合域（Heavy Metal-Associated， HMA）HMA，進一步推測其為重金屬轉(zhuǎn)運P型ATP酶。其他所有獲得的候選基因均含有P型ATP酶的保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域分析表明這些基因主要是轉(zhuǎn)運Na+/K+、Ca2+及重金屬離子的ATP酶（表1）。

Blast分析結(jié)果顯示希金斯炭疽菌中得到38條P型ATP酶候選基因，經(jīng)過SMART分析表明CH063_00399不含P型ATP酶的保守結(jié)構(gòu)域，因此CH063_00399 不屬于P型ATP酶基因家族，確定希金斯炭疽菌中共獲得37條P型ATP酶候選基因。

從表1可以看出，膠孢炭疽菌中Ca2+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有9條，K+/Na+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有6條，磷脂轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有4條，重金屬轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有3條，銅轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有1條，陽離子轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有1條，質(zhì)膜轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因有2條，未明確功能的P型ATP酶基因有3條。禾谷炭疽菌比膠孢炭疽菌少3條P型ATP酶候選基因，分別為Ca2+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因、K+/Na+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因和磷脂轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因。希金斯炭疽菌比膠孢炭疽菌多8條P型ATP酶候選基因，分別為2條Ca2+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因、1條K+/Na+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因、1條磷脂轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因、1條質(zhì)膜轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因和3條未明確功能的P型ATP酶基因。

2.3 3種炭疽菌中P型ATP酶基因的聚類分析

通過MEGA軟件中的最大似然法構(gòu)建3種炭疽菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。由圖1可知，經(jīng)過結(jié)構(gòu)域分析預測的功能相同或相近的基因都聚在了一類。除了膠孢炭疽中的Cg 29經(jīng)結(jié)構(gòu)域分析未確定功能，與具有陽離子轉(zhuǎn)運功能的P型ATP酶基因聚在一起，推測其可能為陽離子轉(zhuǎn)運P型ATP酶。Cg 19為膠孢炭疽菌中的磷脂轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因，Cg 27和Cg 28經(jīng)基因預測和結(jié)構(gòu)域分析未明確功能卻和Cg 19聚在一起，推測Cg 27和Cg 28為磷脂轉(zhuǎn)運的可能性比較大。Cg 12經(jīng)結(jié)構(gòu)域分析預測為Na+/K+轉(zhuǎn)運P型ATP酶基因，但并沒有和其他的具有Na+/K+轉(zhuǎn)運功能的P型ATP酶聚在一起，推測其可能具有獨特的結(jié)構(gòu)。其余與表1中的功能分類結(jié)果相吻合。

2.4 P型ATP酶基因蛋白基序分析

利用MEME程序從3種炭疽菌中的P型ATP酶氨基酸序列中均鑒定出20個不同的基序（motif）（表2～4），在這3種炭疽菌中共同含有6個基序，分別為DGDxND、MxTGD、DPPR、PxD、KGAPE和PxxL。膠孢炭疽菌中有8個基序在90%的P型ATP酶蛋白中均有出現(xiàn)，這8個基序分別為GDGxND，DKTGTLT，MxTGD，DPPR，VxCRxxPxQK，PxD，KGAPE和PxxL。禾谷炭疽菌中同樣有8個基序在90%的P型ATP酶蛋白中均有出現(xiàn)，與膠孢炭疽菌不同的是基序PGD和TGES替代了基序DKTGTLT和VxCRxxPxQK。而希金斯炭疽菌中有10個基序在80%的P型ATP酶蛋白中均有出現(xiàn)，除了共同含有的6個基序外，與膠孢炭疽菌還共同含有2個基序，DKTGTLT和VxCRxxPxQK，與禾谷炭疽菌還共同含有2個基序，PGD和TGES。以上這些基序均是P型ATP酶的已知保守基序[11]。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著大批生物體全基因組的測序，采用生物信息學方法獲得大量的P型ATP酶基因是最快捷有效的分析手段之一。Thever等[11]對26個真核生物進行了P型ATP酶家族基因預測，并對其組成成員間的遺傳距離、保守結(jié)構(gòu)域和拓撲學等進行分析結(jié)果顯示，不同物種間P型ATP酶數(shù)量不同，如在模式生物擬南芥和水稻中已經(jīng)分別發(fā)現(xiàn)有46和41個P型ATP酶家族， 人類中有24個， 煙曲霉（Aspergillus fumigates）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、新型隱球菌（Cyptococcus neoformans）等真菌中家族成員各有11～22個；同屬不同種真菌中存在的P型ATP酶類型也有差異，如3種曲霉（A. fumigates，A. nidulans，A. oryzae）分別含有20、18、22個P型ATP酶基因，其中A. nidulans不含有亞型1基因。但未見炭疽菌P型ATP酶家族基因的分析。本研究利用從TCDB上下載的已知P型ATP酶的氨基酸序列，對已測序的3種炭疽菌全基因組數(shù)據(jù)庫進行tblastn搜索，結(jié)合結(jié)構(gòu)域和聚類分析，從膠孢炭疽菌數(shù)據(jù)庫中共獲得29條，希金斯炭疽菌中共獲得37條，禾谷炭疽菌中共獲得26條P型ATP酶候選基因均多于稻瘟菌中的23個P型ATP酶基因[12]。這也驗證了同屬不同種真菌間P型ATP酶基因的數(shù)量不同。

本研究通過結(jié)構(gòu)域分析和聚類分析結(jié)果表明，這些基因是轉(zhuǎn)運Na+/K+、Ca2+及重金屬離子的ATP酶。在炭疽菌中具有Ca2+和Na+/K+轉(zhuǎn)運的P型ATP酶占一半以上，其次為磷脂和重金屬轉(zhuǎn)運P型ATP酶。聚類分析顯示功能相同或相似的基因聚在一起。本研究結(jié)果為后續(xù)基因功能驗證奠定基礎。

P型ATP酶家族具有9個最保守基序（motif），不同的家族基序的特點不同，特異的基序可能決定著該家族的作用底物與方式[11]。通過MEME程序從3種炭疽菌中的P型ATP酶氨基酸序列中均鑒定出了20個不同的基序，其共同含有6個基序，分別為DGDxND、MxTGD、DPPR、PxD、KGAPE和PxxL。此6個基序?qū)儆赑型ATP酶家族中的9個最保守基序。這為進一步研究炭疽菌中P型ATP酶蛋白基序功能奠定基礎。

參考文獻

[1] Jeffries P， Dodd J C， Jeger M J， et al. The biology and control of Colletotrichum species on tropical fruit crops[J]. Plant Pathology， 1990， 39（3）： 343-366.

[2] Zulfiqar M， Brlansky R H， Timmer L W. Infection of flower and vegetative tissues of citrus by Colletotrichum acutatum and C. gloeosporioides[J]. Mycologia， 1996， 88（1）： 121-128.

[3] 時全昌， 鄭文鋒. 油橄欖炭疽病及其防治研究[J]. 林業(yè)科學，l983， l9（1）： 50-56.

[4] 林春花， 蔡志英，黃貴修. 全基因組法繪制禾谷炭疽菌和希金斯炭疽菌中MAPK級聯(lián)信號途徑簡圖[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（4）： 674-680.

[5] 彭 陳. 稻瘟菌P型ATP酶的基因家族分析及其基因MoCTA1、MoCTA3的研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學， 2012.

[6] Martin J G， Christopher R T， Gavin E W， et al. A P-type ATPase required for rice blast disease and induction of host resistanc[J]. Nature Letters， 2006， 440（23）： 535-539.

[7] Balhadère P V， Foster A J， Talbot N J. Identification of pathogenicity mutants of the rice blast fungus Magnaporthe grisea by insertional mutagenesis[J]. Mol. Plant-Microbe Interact. 1999， 12： 129-142.

[8] Pascale V B， Nicholas J T. PDE1 encodes a P-Type ATPase involved in appressorium-mediated plant infection by the rice blast fungus Magnaporthe grisea[J]. The Plant Cell， 2001， 13（9）： 1 987-2 004.

[9] 蔡志英. 橡膠樹膠孢炭疽菌突變體庫的構(gòu)建及其CgATPase基因功能分析[D]. 海口： 海南大學， 2013.

[10] Milton H， Tamang D G， Elkan C. The Transporter Classification Database： recent advances[J]. Nucleic Acids Research， 2009， 37： 274-278.

[11] Thever M D， Saier Jr M H. Bioinformatic characterization of P-type ATPases encoded within the fully sequenced genomes of 26 eukaryotes[J]. J Membrane Biol， 2009， 229（6）： 115-130.

[12] 郭士偉，李萬昌，彭 陳，等. 稻瘟菌Magnaporthe oryzae P-ATPases基因家族分析[J]. 生物信息學， 2012， 10（1）： 15-19.