許鳳華等

摘要[目的]篩選纖維素酶活力高的纖維素降解真菌，研究其粗酶活性。[方法]從土壤中分離、篩選高效纖維素降解菌，以透明圈試驗和濾紙降解試驗驗證其降解能力，通過菌落菌絲形態(tài)及rDNA-ITS序列測序鑒定菌株種屬，通過改變培養(yǎng)時間、氮源、裝液量、起始pH及培養(yǎng)溫度5個因素探討纖維素降解真菌的最適產(chǎn)酶條件。[結(jié)果]得到3株纖維素降解真菌QS2、QS6和QW9，經(jīng)鑒定確定QS2和QS6屬青霉屬（Penicillium），QW9為康寧木霉（Trichoderma koningii）。QS6菌株的FPA酶活和CMC酶活在3個菌株中均表現(xiàn)活力最高，且最適產(chǎn)酶條件為32 ℃時氮源為磷酸銨、起始pH 6.0、裝液量100 ml，培養(yǎng)時間14 d。[結(jié)論]高效纖維素降解真菌粗酶活性的研究為纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞纖維素；真菌；降解能力；FPA酶活；CMC酶活

纖維素（cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機(jī)溶劑，是植物細(xì)胞壁的主要成分。纖維素是自然界中分布最廣、含量最多的一種多糖，占植物界碳含量的50%以上[1]。同時，纖維素也是一種可再生資源，能被很多種微生物有效轉(zhuǎn)化為單糖，并通過后續(xù)的加工來生產(chǎn)乙醇等能源物質(zhì)或其他工業(yè)產(chǎn)品。目前，研究較多的包括木霉（Trichoderma）、曲霉（Aspergillus）、青霉（Penicillium）和纖維單胞菌屬（Cellulomonas）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）等[2]。

纖維素酶是降解纖維素成為葡萄糖單體所需的一組酶的總稱。它不是單種酶，而是起協(xié)同作用的多組分酶系，一般認(rèn)為主要包括內(nèi)切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）、β葡萄糖苷酶三類酶組分[3-4]。纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)及高酶活性的保持一直是纖維素酶在生產(chǎn)應(yīng)用中亟待解決的問題。筆者擬從土壤中分離高效纖維素降解菌，篩選出酶活較高的纖維素降解菌，并進(jìn)行分子鑒定，同時對其粗酶活性進(jìn)行分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品的采集。采集大慶森林公園多年生針葉林落葉底層的土壤，進(jìn)行纖維素降解真菌的篩選及分離、純化。

1.1.2培養(yǎng)基的配制。篩選培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g，MgSO4 0.5 g，KH2PO4 0.5 g，CMCNa 2.0 g，蛋白胨1 g，剛果紅0.2 g，瓊脂條20 g，蒸餾水1 000 ml（自然pH），滅菌冷卻；

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，20%土豆汁1 L，pH自然，最后定容到1 000 ml；

產(chǎn)酶培養(yǎng)基：KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2 02 g，F(xiàn)eCl3 0.03 g，NaCl 0.1 g，濾紙片20 g，定容到1 000 ml，pH 72～7.5。

1.2方法

1.2.1纖維素降解真菌的篩選及分離、純化。將土壤樣品過篩，去除雜草、石塊等雜物，稱取3 g土壤樣品，放入無菌水中充分懸浮，靜置1 h后吸取上清液，進(jìn)行梯度稀釋，分別獲得原液、10-1、10-2、10-3以及10-4的菌液，各取100 μl均勻涂布在篩選培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)。待長出菌落后，挑取長勢良好的不同菌落形態(tài)的真菌在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行反復(fù)三區(qū)劃線，直至得到純化的單菌落，再切下單菌落邊緣部分接種到PDA平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)作為種子。

1.2.2纖維素降解真菌的鑒定。挑取純種的真菌菌絲，加入50 ml液體PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，140 r/min振蕩培養(yǎng)約3 d，將菌液中的菌絲過濾抽干，利用CTAB法進(jìn)行基因組DNA的提取，利用ITS引物擴(kuò)增18S rDNA序列，經(jīng)測序后在NCBI上進(jìn)行比對，確定菌株的近源種。

1.2.3纖維素降解真菌降解能力的測定。

1.2.3.1透明圈法。在以纖維素為唯一碳源的固體培養(yǎng)基上接種纖維素降解真菌，28 ℃培養(yǎng)3 d，測定菌落直徑（d，cm）和水解圈直徑（D，cm），用HC[5]表示水解能力。

HC =（D/d）2

1.2.3.2濾紙條降解法。將直徑約1 cm纖維素降解真菌菌塊接種于50 ml以濾紙塊為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，80 r/min，28 ℃振蕩培養(yǎng)2～7 d后觀察濾紙崩潰情況，反映纖維素降解真菌的降解能力[6]。

1.2.4纖維素降解真菌粗酶活的測定。

1.2.4.1粗酶液的制備。吸取發(fā)酵液1 ml于10 ml離心管，平衡后于1 000 r/min、4 ℃下離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.2.4.2酶活力的測定。采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS法），測定總纖維素酶活力濾紙酶活（FPAase）和內(nèi)切1，4-葡聚糖酶活力（CMCase）。

1.2.4.3CMC酶活力的測定。取1.5 ml羧甲基纖維素鈉溶液，加入0.5 ml粗酶液，50 ℃反應(yīng)30 min后加入1.5 ml DNS試劑，沸水浴5 min，立即冷卻，加入1.5 ml蒸餾水，540 nm比色。在上述條件下，1 ml粗酶液在1 min內(nèi)催化底物生成1 pg葡萄糖的酶量為一個酶活力單位（U）[7]。

1.2.4.4濾紙酶（FPA）活力的測定。分別稱取0.5 g濾紙小孔于試管內(nèi)，加入檸檬酸緩沖液（pH 5），再加入0.5 ml粗酶液，輕輕搖勻，使濾紙完全浸泡在液體中；在50 ℃溫度下保溫60 min后，同上采用DNS法測定還原糖[8]。酶活定義同上。酶活通過以下公式計算。

酶活（U）=（OD值×0.724 1×0.039 4）×5×1 00030×0.5

式中，5為定容到的體積，單位為ml；1 000為單位換算；30為反應(yīng)時間，單位為min；0.5為粗酶液體積，單位為ml。

纖維素酶可將地球上最豐富（占全球總生物量80%）、最廉價的可再生資源纖維素轉(zhuǎn)化為能被直接利用的能源和資源。這是很多科學(xué)工作者一直致力研究的方向。然而，纖維素酶的發(fā)酵生產(chǎn)及高酶活性的保持一直是生產(chǎn)上難以徹底解決的問題。真菌中的纖維素酶含量較高，活性較強(qiáng)，因此分離纖維素降解真菌，并對其粗酶活性進(jìn)行研究，能夠為纖維素酶液以及獲得較高活性纖維素酶提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

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