【摘要】近幾年，端粒酶的相關(guān)研究非?；钴S，隨著研究的深入，人們對其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能和性質(zhì)有了更深的了解，因此對細(xì)胞的癌變有了新的認(rèn)識，即端粒酶的檢測技術(shù)對惡心腫瘤的早期診斷及后期監(jiān)測提供了數(shù)據(jù)支持，本文通過端粒酶的熒光檢測法對癌細(xì)胞的檢測方法進(jìn)行了研究。

【關(guān)鍵詞】端粒酶；癌細(xì)胞；腫瘤診斷

1、實驗

1.1培養(yǎng)HeLa細(xì)胞

1.1.1培養(yǎng)基的制作：RPMI1640培養(yǎng)基，在加入1%至2%的瓊脂做冷凝劑后，補(bǔ)充培養(yǎng)100U/mL的鏈霉素、青霉素和10%的胎牛血清。

1.1.2細(xì)胞的培養(yǎng)：先將這些細(xì)胞放在含95%空氣，5%二氧化碳的37攝氏度的氣氛中培養(yǎng)，在細(xì)胞的繁殖期，再加入胰蛋白酶之前需要先將泛黃的培養(yǎng)基倒盡，再放入培養(yǎng)箱中大約五分鐘，待其消化完畢，倒出，再加入新的培養(yǎng)基，吹洗兩分鐘后，當(dāng)觀察到細(xì)胞從壁上脫落，并且細(xì)胞團(tuán)被吹散停止，然后用血球計數(shù)板計數(shù)。

1.2端粒酶的提取及預(yù)處理

1.2.1提取端粒酶：第一步，將計數(shù)收集到的1.0×106個細(xì)胞置于1.5mL的離心管中，在2000轉(zhuǎn)4攝氏度的條件下離心3分鐘達(dá)到去除培養(yǎng)基的作用，再用0.3M的氯化鈉溶液在弱堿性條件下洗滌三次，棄去上清液后，加入0.1mL的裂解液，然后冰浴裂解0.5h（移液槍抽取三次），再在4攝氏度1200轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，取出上清液于離心管中，迅速置于液氮中冷卻，備用。

1.2.2固定DNA探針：在處理好的金電極表面滴加疏基修飾的寡核咁酸探針的TE-氯化鈉緩沖液，在4攝氏度下組裝，然后將組裝完畢的電極放在弱堿性的氯化鈉溶液中清洗10分鐘，達(dá)到除去吸附探針的效果。

1.3熒光性的電化學(xué)分析

1.3.1電化學(xué)響應(yīng)：傳感器對端粒酶影響的電化學(xué)特征變化為：在端粒酶存在的條件下，T鏈的S沿著3號末端開始擴(kuò)散增重得到S3長鏈，新增的重復(fù)段的序列與雜交區(qū)域的堿基是互補(bǔ)的，不能構(gòu)成穩(wěn)定的雙鏈，用二價鐵標(biāo)記的DNA鏈的S2會產(chǎn)生很小的電流峰，隨后加入HeLa滅活細(xì)胞的提取物，將被熱破壞的RNA模板用引物鏈來擴(kuò)增S1，此時，兩個鏈會發(fā)生堿基的互補(bǔ)配對，由二茂鐵標(biāo)記的S2在靠近電機(jī)的表面時發(fā)生電子傳遞，由還原峰電流可以看出電子傳遞效應(yīng)十分高效。同理，我們又引入了探針S4和S5，在端粒酶存在的條件下，得到了TTGAAA堿基長鏈，但與S1不同的是，他仍有8個互補(bǔ)的堿基對，并且通過電分析信號，發(fā)現(xiàn)在0.23V處產(chǎn)生了明顯的信號。接下來，我們設(shè)計了一組對比試驗（空白試驗），在其與條件相同的情況下，加入了端粒酶的失活物，結(jié)果在傳感器譜圖立刻出現(xiàn)了一個峰，與標(biāo)準(zhǔn)譜圖比較后發(fā)現(xiàn)，這是一個典型的二茂鐵還原峰。綜上，我們可以得出這樣一個結(jié)論，在端粒酶存在的情況下，由二茂鐵標(biāo)記的S2 DNA鏈上的Fc從電極表面釋放下來。

1.3.2熒光活性的檢測：將HeLa細(xì)胞裂解后，提取10微升的DNA修飾液，調(diào)節(jié)pH至8.2，再計入1.5微升飽和氯化鎂和氯化鉀溶液，32攝氏度恒溫箱中放置2h，然后使用熒光分光光度計進(jìn)行熒光強(qiáng)度的檢測。

1.3.3延伸性的電化學(xué)檢測：將60微升的裂解后的端粒酶擴(kuò)增液等分成十份，每份加入10微升的EDTA，同樣置于32攝氏度的恒溫箱2h，需要注意的是裂解液是NB-47裂解液在90攝氏度水中滅火0.5h后加入等體積鹽酸后的溶液。將電極插入由3毫升NB-47和12毫升DPR混合液中，再進(jìn)行電化學(xué)檢測。

1.3.4端粒酶的膠體性電泳檢測：先稱取1g瓊脂，在電爐上配成瓊脂的飽和液，再加入1.3.3中得到的液體和20mLTBE電泳緩和液，加熱至溶膠整體呈透明狀，冷卻后倒入電泳槽中，需控制溶膠層的厚度在0.30cm至0.52cm，再加入少量緩沖液，準(zhǔn)備點樣（用熒光標(biāo)記的探針和非疏基標(biāo)記探針分別在S6和S7的1：1混合液中退火雜交，然后讓雜交后的的產(chǎn)物在ETA中擴(kuò)增）。3微升的酚溴藍(lán)和8微升的端粒酶提取液，混合十分鐘后，倒入電解槽中，通電，電壓控制在100V，時間1.5h，利用電泳凝膠成像儀成像檢測。

1.4癌細(xì)胞分析

1.4.1檢測標(biāo)準(zhǔn)選擇：MRNAturalist與端粒酶的活性無關(guān)，但是在mRNA發(fā)生htert表達(dá)后則會相關(guān)，所以htert后的mRNA可用于對腫瘤細(xì)胞的檢測標(biāo)定，與腫瘤病理分期Ki-67的表達(dá)相關(guān)。并且有研究證實，盡管htert的表達(dá)水平與預(yù)后沒有關(guān)系，但是它的完整長度htert的剪形與腫瘤的病理分期還是一樣的，可作為檢測標(biāo)準(zhǔn)。

1.4.2技術(shù)問題分析：不是所有的腫瘤標(biāo)本都能夠檢測到端粒酶，這和腫瘤細(xì)胞的病理分期、細(xì)胞的分化程度和組織學(xué)分型有關(guān)，有些階段和類型的腫瘤細(xì)胞內(nèi)并沒有端粒酶或者里面的端粒酶根本不表達(dá)，這對惡心腫瘤的早期診斷、治療、監(jiān)測和預(yù)后判斷造成一定的影響，可能存在的原因有以下幾點：（1）端粒酶的活性太低，低于檢測線，導(dǎo)致檢測不到；（2）檢測端粒酶主要監(jiān)測的是端粒酶的表達(dá)效果，有些端粒酶是不表達(dá)的；（3）所監(jiān)測的樣本中存在檢測抑制物或干擾物，影響檢測；（4）腫瘤細(xì)胞的生長周期處于靜止期，導(dǎo)致端粒酶的活性降低；（5）腫瘤細(xì)胞彼此之間發(fā)生了重組，導(dǎo)致基因組重組，加長了端粒酶的長度。

2、結(jié)論

端粒酶檢測技術(shù)已經(jīng)可以在腫瘤診斷中起作用，但是由于端粒酶活性過低、癌細(xì)胞生長周期以及發(fā)生重組等原因，仍會對檢測造成影響，但是端粒酶的活性是細(xì)胞增殖的生物學(xué)的一個重要的指標(biāo)，特別是在未來生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。因此，在端粒酶診斷惡心腫瘤時要慎重對待，考慮以上提及的各種情況，以免發(fā)生誤導(dǎo)。

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作者簡介

戴鑫禹（1994-），女，漢族，遼寧省海城市人，本科，單位：沈陽師范大學(xué)，研究方向：生物科學(xué).