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枸杞中黃酮類化合物提取與分離純化工藝的研究進(jìn)展

2015-10-21 19:57于惠康磊等??
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年5期
關(guān)鍵詞:分離純化提取枸杞

于惠 康磊等??

摘要 近幾年,隨著枸杞的化學(xué)成分和藥理作用的廣泛研究,枸杞總黃酮因具明顯的抗氧化、清除自由基、提高免疫力等活性而逐漸成為研究熱點(diǎn),因此人們采用多種方法對(duì)枸杞黃酮進(jìn)行提取分離。在此從枸杞黃酮的提取和分離提純兩方面進(jìn)行總結(jié),為今后的分離提純提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 枸杞;黃酮;提?。环蛛x純化;研究進(jìn)展

中圖分類號(hào) S567;TS225.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A 文章編號(hào) 0517-6611(2015)05-062-03

Research Progress of Separation and Extraction Flavones in Lycium barbarum

YU Hui1, 2, KANG Lei1, 2, ZHANG Rui1, 2 et al (1. State Key Testing Laboratory of Coal Chemical, Yinchuan, Ningxia 750002; 2. Chemical Laboratory Center of Ningxia Baota, Yinchuan, Ningxia 750002)

Abstract In recent years, the chemical composition and pharmacological function of Lycium barbarum has been extensively studied, the total flavones in Lycium barbarum has been gradually become a hot topic because of significant antioxidation, removal of the free radicals, enhancing immunity and other activities. Thus, many researchers used variety methods to separate and extract the total flavones from Lycium barbarum. The separation and extraction of total flavones from Lycium barbarum were summarized, providing a reference for separation and purification in future.

Key words Lycium barbarum; Flavones; Extraction; Separation and purification; Research progress

基金項(xiàng)目 寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ13255)。

作者簡(jiǎn)介 于惠(1986-),女,遼寧凌源人,工程師,碩士,從事分離型功能高分子材料研究。

收稿日期 20141226

枸杞 (Lycium Barbarum)為茄科枸杞屬,多年生落葉小灌木植物,是我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用同源植物之一[1]。枸杞的藥用部位較多,明朝李時(shí)珍《本草綱目》記載:“春采枸杞葉,名天精草;夏采花,名長(zhǎng)生草;秋采子,名枸杞子;冬采根,名地骨皮”。枸杞子為枸杞的成熟干燥果實(shí),其活性成分主要包括色素類、多糖類、黃酮類化合物、多種氨基酸、維生素及微量元素[2]。枸杞子具有滋補(bǔ)肝腎、益精明目之功效,現(xiàn)代臨床上廣泛用于調(diào)節(jié)免疫功能[3]、抗氧化[4]、抗輻射[5]、抗腫瘤[6]、清除自由基[7]、促進(jìn)益生菌細(xì)胞生長(zhǎng)及抗衰老[8]等。枸杞葉,又名天精草,為茄科植物枸杞或?qū)幭蔫坭降哪矍o葉,功能補(bǔ)肝益腎、生津止渴、虛勞發(fā)熱。枸杞葉中的活性成分與枸杞子類似,其蛋白質(zhì)含量極其豐富,另外據(jù)報(bào)道枸杞葉中含有豐富的有機(jī)鍺,具有增強(qiáng)免疫力、延緩衰老的功效[9]。枸杞根皮,又稱為地骨皮,為茄科、枸杞屬植物枸杞的根皮,可入藥,具有清熱、涼血、降壓、清肺降火等功效。我國(guó)枸杞有7個(gè)種3個(gè)變種,其中以寧夏地區(qū)生產(chǎn)的寧夏枸杞 (Lycium Barbarum L.) 最為著名[10],青海、甘肅等地的枸杞品質(zhì)也很高。近幾年,枸杞的化學(xué)成分和藥理作用被廣泛的研究,作為枸杞中重要的活性物質(zhì)之一,枸杞總黃酮因具明顯的抗氧化、清除自由基、降血脂、降血糖、治療心腦血管疾病、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等活性而逐漸成為研究熱點(diǎn)[11-12]。

枸杞中黃酮類化合物的提純,主要包括以下兩方面:一方面是提取,基于植物不同部位所含黃酮類化合物的結(jié)合狀態(tài)不同,如在花、果、葉中以甙為主要存在形式,在木質(zhì)部分以甙元為主要存在形式,需要根據(jù)被提取物的類型和理化性質(zhì)選擇合適的提取溶劑和提取方法;另一方面是分離純化,目的是盡可能充分將黃酮類化合物與其他成分分開(kāi),并進(jìn)一步分離得到黃酮類成分單體。筆者在此對(duì)近年來(lái)枸杞中黃酮類化合物的提取與分離純化工藝的研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié)。

1 提取方法

1.1 有機(jī)溶劑提取法

有機(jī)溶劑提取法是國(guó)內(nèi)外使用最為廣泛的一種提取方法,主要以乙醇、甲醇、石油醚等有機(jī)溶劑作為提取溶劑,在索氏提取器中進(jìn)行抽提。通常采用乙醇作為提取溶劑,提取的過(guò)程中,乙醇的濃度對(duì)黃酮類化合物的提取存在影響。高濃度的醇(90%~95%)適用于提取黃酮甙元類化合物,而低濃度的醇(60%~70%)更適合提取黃酮甙類化合物[13]。該方法操作簡(jiǎn)單、成本低,易于大規(guī)模生產(chǎn),但工藝繁瑣,雜質(zhì)含量也較高,回收率低。李銘芳等采用70%的乙醇為溶劑回流提取寧夏枸杞中的總黃酮,通過(guò)正交試驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn)最優(yōu)提取條件為提取溫度70 ℃、提取時(shí)間2.0 h、固液比為1∶20[14]。劉蘭英等以70%乙醇對(duì)枸杞葉進(jìn)行回流提取,并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了提取工藝條件為70%乙醇、料液比1∶8、提取時(shí)間3 h、提取3~8 nm碎粒,黃酮得率為3.72%[15]。

1.2 超聲輔助提取法

超聲波的作用機(jī)理是在被提取樣品和溶劑之間產(chǎn)生聲波空化效應(yīng)[16],破壞植物細(xì)胞并加速溶劑分子之間的運(yùn)動(dòng),使植物細(xì)胞中的有效成分較易溶解于溶劑中,加速了植物有效成分的浸出提取。另一方面,超聲提取過(guò)程中的空化作用還會(huì)增大樣品與提取溶劑之間的接觸面積,從而提高植物中活性成分從固相轉(zhuǎn)移到液相的傳質(zhì)速率[17]。因此,對(duì)植物有效成分采用超聲提取,可以在很大程度上加快提取速度,縮短了提取時(shí)間,進(jìn)而提高了天然產(chǎn)物中活性成分的提取速率和提取量。該方法節(jié)省提取時(shí)間、提高提取效率、試驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便,在工業(yè)生產(chǎn)中具有較為廣闊的應(yīng)用前景。王漢卿等通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選出超聲輔助提取枸杞葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù) 65%、乙醇用量 1∶60、超聲提取時(shí)間 35 min、超聲溫度 70 ℃;利用優(yōu)選出的最佳超聲提取工藝測(cè)定比較不同采收期枸杞葉中的總黃酮含量,結(jié)果為5月中旬含量最高[18]。孫化鵬等通過(guò)正交試驗(yàn)法優(yōu)選出超聲輔助提取枸杞葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇濃度75%、乙醇用量1∶40、超聲提取時(shí)間30 min、超聲提取溫度50 ℃[19]。

1.3 微波輔助萃取法

微波萃取又稱微波輔助萃?。∕iacrowaveassisted extraction,MAE),是利用微波的熱效應(yīng)對(duì)樣品及其有機(jī)溶劑進(jìn)行加熱,從而將目標(biāo)組分從樣品基體中分離出來(lái)的一種新型高效分離技術(shù)。微波萃取過(guò)程是高頻電磁波穿透萃取介質(zhì)到達(dá)物料內(nèi)部,微波能轉(zhuǎn)化為熱能,物料內(nèi)部的溫度迅速上升,使物料內(nèi)部的壓力超過(guò)細(xì)胞壁膨脹所能承受的壓力,導(dǎo)致細(xì)胞膨脹破裂,從而促使有效成分自由流出,并溶解于萃取介質(zhì)中[20]。微波加熱不同于傳統(tǒng)的加熱模式,即熱量由外向內(nèi)傳遞,而是直接作用于內(nèi)部和外部的介質(zhì)分子,使整個(gè)物料同時(shí)被加熱,即“體加熱過(guò)程”,從而可克服傳統(tǒng)的傳導(dǎo)式加熱方式所存在的升溫較慢的缺陷。同時(shí),微波所產(chǎn)生的電磁場(chǎng)可加速被萃取組分的分子由固體內(nèi)部向固液界面擴(kuò)散的速率,從而使萃取速率提高數(shù)倍,并能降低萃取溫度,最大限度地保證萃取物的質(zhì)量[21]。

與其他的提取方法相比較,微波輔助萃取具有如下優(yōu)點(diǎn):①選擇性好。由于樣品中各組分對(duì)微波的吸收能力存在差異,從而導(dǎo)致其溫度不同,致使各組分從基體中分離的速度也存在差異。因此,微波萃取能對(duì)萃取體系中的不同組分進(jìn)行選擇性加熱,可以使目標(biāo)組分直接從基體中分離。②熱效率較高。微波加熱是內(nèi)外同時(shí)加熱的模式,由微波能量直接轉(zhuǎn)化為熱能,沒(méi)有熱傳遞造成的溫度梯度和熱量損失,因而加熱均勻,熱效率較高。③質(zhì)量穩(wěn)定??梢栽谳^低的溫度下完成萃取,有效地保護(hù)了被提取物的有效成分。④操作簡(jiǎn)單。微波萃取無(wú)需干燥等預(yù)處理,簡(jiǎn)化了工藝,減少了投資。

巨敏等以枸杞為原料,用乙醇作為提取劑,采用微波提取法對(duì)枸杞中總黃酮進(jìn)行提取,以二次同歸正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化分析,得出的最佳條件為乙醇濃度68.3%、微波時(shí)間100 s、微波溫度73 ℃、微波功率300 W、液料比14.7∶1.0(ml/g),在最佳條件下,總黃酮的提取率為19.52 mg/g[22]。孫波等以蘆丁為對(duì)照品,采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)時(shí)影響枸杞總黃酮提取率的因素進(jìn)行了考察,并優(yōu)選出最佳提取工藝為乙醇濃度70%、料液比1∶30(g/ml)、微波輻射功率400 W、溫度120 ℃、提取時(shí)間8 min,在此條件下枸杞總黃酮的含量為18.3 mg/g[23]。

1.4 磁場(chǎng)強(qiáng)化萃取法

磁場(chǎng)強(qiáng)化萃取是一種借助外加磁場(chǎng)以強(qiáng)化化工分離過(guò)程的新技術(shù),被稱為“綠色分離技術(shù)”,它可以利用磁場(chǎng)產(chǎn)生的特殊能量來(lái)改變抗磁性物質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu),使其理化性質(zhì)發(fā)生變化[24],同時(shí)通過(guò)影響反應(yīng)速率來(lái)起到強(qiáng)化萃取的作用。周蕓等以新鮮枸杞為原料,采用磁場(chǎng)強(qiáng)化萃取法提取枸杞黃酮,通過(guò)正交試驗(yàn),得出優(yōu)化磁場(chǎng)處理的最佳條件為:在磁感應(yīng)強(qiáng)度 640 mT、磁化時(shí)間 40 min、磁化溫度 65 ℃、浸提回流時(shí)間 60 min 的條件下,枸杞黃酮的提取率可達(dá)290.81 mg/100g[25]。李冰等發(fā)明一種利用磁性吸附樹(shù)脂及外加磁場(chǎng)分離純化葛根黃酮的方法,具體的工藝流程如圖1所示。首先,將葛根粉碎置于微波萃取罐中,加入95%乙醇,微波萃取除去雜質(zhì)后得葛根黃酮提取液;其次,將磁性吸附樹(shù)脂裝入樹(shù)脂柱,置于可調(diào)磁場(chǎng)中,將葛根黃酮提取液流過(guò)樹(shù)脂柱,收集解吸液,濃縮干燥后得葛根黃酮產(chǎn)品[26]。

1.5 高壓均質(zhì)提取法

高壓均質(zhì)提取法是指利用柱塞泵將被分離物保持在一定的壓力條件下,液料高速流過(guò)一個(gè)狹窄的縫隙時(shí)而受到強(qiáng)大的剪切力,同時(shí)還有液料與金屬環(huán)接觸產(chǎn)生的碰撞力以及由于靜壓驟降和驟升而產(chǎn)生的孔爆發(fā)力等綜合力的作用,使原料中不透明、粒徑較大的懸濁液轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定細(xì)小的懸濁液的過(guò)程[13]。高壓均質(zhì)提取法可以將樣品中的組成結(jié)構(gòu)破粹到納米級(jí),利于目標(biāo)成分的溶出,大大提高了樣品的提取率。同時(shí),操作時(shí)溫度較低,因此對(duì)樣品的破壞力較小,可以保持樣品原有的性質(zhì)。因此,該方法將在天然活性成分的提取方面展現(xiàn)越來(lái)越重要的作用[27]。

劉增根等考察了高壓均質(zhì)提取柴達(dá)木枸杞葉有效成分的最佳工藝及對(duì)有效成分進(jìn)行了純化,發(fā)現(xiàn)高壓均質(zhì)提取柴達(dá)木枸杞葉總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù) 80%、料液比 1∶10、均質(zhì)壓力 60 MPa、提取時(shí)間 30 min,在該條件下,提取物中蘆丁質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10.53%,總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.61%[28]。

2 分離純化方法

2.1 大孔吸附樹(shù)脂吸附分離法

大孔吸附樹(shù)脂(Macroporous Adsorption Resin,MAR)是由功能單體、交聯(lián)劑等可聚合成分與致孔劑、分散劑等添加劑經(jīng)懸浮或反相懸浮聚合制備而成的一類球狀的多孔高分子吸附分離材料,其內(nèi)部存在大大小小、形狀各異、相互貫通的孔穴,即使在干燥狀態(tài)下,其內(nèi)部均具有較高的孔隙率,且存在大孔結(jié)構(gòu)(一般在100~1 000 nm)。MAR不同于離子交換樹(shù)脂,其本身不含可交換性功能基,它的吸附性主要依靠范德華力(包含色散力、定向力和誘導(dǎo)力等)和氫鍵的作用,同時(shí),網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和很高的比表面積又賦予其良好的吸附性能和篩分性能,因此,MAR是一類不同于離子交換樹(shù)脂的、集吸附和篩分性能為一體的分離型功能高分子材料。目前,國(guó)內(nèi)外MAR的生產(chǎn)廠家主要有美國(guó)RohmHass、日本三菱化成公司、天津南開(kāi)大學(xué)化工廠、華北制藥廠樹(shù)脂分廠、西安藍(lán)曉科技有限公司、西安藍(lán)深特種樹(shù)脂有限公司、滄州寶恩化工有限公司、天津海光化工有限公司等,部分廠家產(chǎn)品的性能如表1~3所示[29-30]。

目前,MAR主用于皂苷類、黃酮及其苷類、蒽醌及其苷類、酚酸類、色素類及生物堿類等的分離純化。利用MAR分離純化中草藥中的有效成分,有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):首先,由于MAR獨(dú)特的吸附性和篩分性,利用MAR分離純化了多種單味中草藥的有效成分,這為其他中草藥的提取研究奠定了基礎(chǔ);其次,不斷有新的MAR問(wèn)世,這為中草藥有效成分的分離富集提供了可供選擇的保障。

胡曉蓮等通過(guò)優(yōu)選MAR,并考察其工藝參數(shù),篩選合適的吸附樹(shù)脂DA201,最佳的工藝條件為上樣量10柱床體積(BV)、上樣液濃度15 mg/ml、上樣液流速1 BV/h,上樣液pH=3,解吸洗脫劑乙醇濃度為40%、乙醇用量8 BV,富集純化總黃酮得率75.85%,總黃酮純度35.70%[31]。何彥峰等通過(guò)比較11種MAR的靜態(tài)吸附解吸性能,篩選出適合純化柴達(dá)木枸杞總黃酮的樹(shù)脂類型HPD400;并進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附解吸試驗(yàn),利用單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化MAR純化柴達(dá)木枸杞總黃酮,得到的的最佳工藝條為:以16.0 ml pH為4.0的柴達(dá)木枸杞總黃酮粗提液上柱,流速1.0 ml/min,充分吸附后用3 BV去離子水洗柱,然后用23.0 ml 80%乙醇溶液以流速1.0 ml/min進(jìn)行解吸,枸杞黃酮的平均回收率為89.92%,含量為27.62%,約為純化前總黃酮含量的5倍左右[32]。

2.2 高效液相色譜法(HPLC)

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)又稱“高壓液相色譜”,以液體為流動(dòng)相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。HPLC具有高壓、高效、高速、高靈敏度及應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)。

董靜洲等對(duì)寧夏枸杞果實(shí)黃酮提取液進(jìn)行色譜柱分離,檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm,流動(dòng)相 A為1.0%乙酸,流動(dòng)相 B為甲醇,流速為1.0 ml/min;并對(duì)我國(guó)寧夏枸杞六大產(chǎn)區(qū)的枸杞果實(shí)總黃酮提取液進(jìn)行了 HPLC 分離和 HPLC 指紋圖譜比較[33]。張自萍等以10個(gè)寧夏不同產(chǎn)地的寧夏枸杞主栽品種“寧杞I號(hào)”樣品建立枸杞黃酮類化合物指紋圖譜共有模式,采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,對(duì)15個(gè)不同來(lái)源的枸杞樣品進(jìn)行了分析[34]。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年

3 展望

近幾年,隨著人們對(duì)枸杞黃酮的化學(xué)成分和藥理作用不斷深入研究,使枸杞黃酮愈來(lái)愈受到人們的重視。因此,通過(guò)不斷地探索枸杞黃酮提取和分離純化工藝研究的新方法,仍將是提純枸杞黃酮的熱點(diǎn)研究方向。

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責(zé)任編輯 黃小燕 責(zé)任校對(duì) 況玲玲

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