羅臻 黃靜敏 陳血建 賴心田 蘭全學(xué) 楊國武

摘要 膠原蛋白（PSC）是海參蛋白的主要組成，研究其理化性質(zhì)為海參的進(jìn)一步利用提供理論基礎(chǔ)。以格皮氏海參為原料，采用胃蛋白酶促溶法提取海參膠原蛋白，并通過聚丙烯酰胺凝膠凝膠電泳、氨基酸分析以及傅立葉紅外光譜對其理化性質(zhì)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，海參膠原蛋白分子組成為（α₁）₃，α₁的分子量約為150 kD;氨基酸組成以甘氨酸含量最高（6.01%），脯氨酸與羥脯氨酸含量為6.14%，符合水產(chǎn)膠原蛋白特征;傅立葉紅外光譜分析結(jié)果表明其保持三螺旋結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞 膠原蛋白;海參;提取;理化性質(zhì)

中圖分類號 S986.1;O657.7+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A ?文章編號 0517-6611（2015）03-145-02

Extraction and Physicochemical Properties of Pepsinsolubilized Collagen from Sea Cucumber

LUO Zhen， HUANG Jingmin， CHEN Xuejian， YANG Guowu* et al

（Shenzhen Academy of Metrology and Quality Inspection， Shenzhen， Guangdong 518000）

Abstract Pepsinsolubilized collagen （PSC） is the main component of sea cucumber protein， and the study of its physicochemical properties will provide theoretical basis for taking better advantage of sea cucumber. PSC was extracted by pepsinsolution method from sea cucumber （Pearsonothuria graeffei） and analyzed through SDSPAGE， amino acid composition analysis and FTIR. The results of SDSPAGE suggested the structure of PSC Was（α₁）₃and the molecular weight of α₁chain was about 150 kD. Amino acid composition analysis showed that the content of glycine was high（6.01%）， and the level of proline and hydroxyproline was 6.14%， in accordance with the aquatic collagen characteristics. FTIR spectrogram indicated the existence of triplehelix structure.

Key words Collagen; Sea cucumber; Extraction; Physicochemical property

作者簡介 羅臻（1988- ），男，廣東清遠(yuǎn)人，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物。*通訊作者，高級工程師，從事生物化學(xué)方面的研究。

收稿日期 20141120

海參屬于無脊椎棘皮動物們，具有較高的營養(yǎng)價值與藥學(xué)價值，是我國重要的食藥用保健品^[1]。海參體內(nèi)含有蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、多種微量元素、膠質(zhì)、海參、海參皂甙和酸性粘多糖等成分，但不含有膽固醇^[2]。膠原蛋白是海參蛋白的主體，是海參體內(nèi)含量最為豐富的一種生物活性成分。由多糖蛋白分子組成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)使膠原蛋白具有合成高分子所無可比擬的生物相容性、生物降解性和低抗原性，具有一系列重要的生物學(xué)功能^[3]。膠原蛋白的提取方法有很多，其基本原理都是根據(jù)膠原蛋白的特性來改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，從其他蛋白質(zhì)中分離出來，在實(shí)際提取過程中不同方法往往相互結(jié)合^[4]。筆者以海參為原料，通過酸、酶結(jié)合法提取膠原蛋白，使海參資源得以合理開發(fā)與利用，從而利于提高其加工的綜合效益及經(jīng)濟(jì)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 格皮氏干海參;

胃蛋白酶（Sigama公司）;醋酸、氫氧化鈉（分析純，天津市紅巖化學(xué)試劑廠）;磷酸氫二鈉（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）;氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）;EDTA、TRIS（分析純，深圳新拓?fù)渖锟萍加邢薰荆?β巰基乙醇（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨（Biosharp生物科技有限公司）;甘氨酸（美國Amresco公司）;30%丙烯酰胺（美國Biorad公司）。

1.2 試劑配制

配制含0.5 mol/L NaCl、50 mmol/L EDTA、0.2 mol/L β巰基乙醇、0.1 mol/L TrisHCl（pH 8.0）的海參提取液1 000 ml待用。

1.3 儀器

GL加熱磁力攪拌器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;T25高速組織搗碎機(jī)（德國IKA公司）;pH計、高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter公司）;U410超低溫冷凍貯存箱（B德國Eppendorf公司）;BT 224S電子天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）;ALPHA 12真空冷凍干燥機(jī)（德國Christ公司）;SDSPAGE電泳儀（美國Biorad公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 膠原蛋白的提取^[5]。

將去除內(nèi)臟的海參原材料粉碎后，稱取100 g組織碎片，加入1 000 ml提取液浸泡，置于4 ℃中攪拌72 h，紗布過濾后取濾液離心（7 500 g，30 min），將沉淀物用雙蒸水洗至中性，置于冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥;稱取1 g干燥物，加入1 000 ml 0.1 mol/L NaOH浸泡，4 ℃攪拌24 h，離心（7 500 g，30 min）后沉淀水洗至中性，凍干;重懸浮于500 ml 0.5 mol/L乙酸中，按干重比100∶6加入胃蛋白酶充分?jǐn)嚢瑁? ℃下提取48 h后離心（7 500 g，1 h），取上清液加入NaCl至終濃度為0.8 mol/L進(jìn)行鹽析，離心（9 000 g，1 h），沉淀重懸浮于0.5 mol/L乙酸，于0.02 mol/L磷酸氫二鈉（pH 8.0）中透析48 h，每隔3 h更換透析液，離心后取沉淀再溶于0.5 mol/L 乙酸，在0.1 mol/L 乙酸中透析48 h，冷凍干燥即得胃蛋白酶促溶膠原蛋白制品（P S C）。

1.4.2 SDSPAGE分析。

采用SDSPAGE垂直電泳，分離膠濃度為10%，濃縮膠濃度為5%，Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。電泳緩沖液為Tris甘氨酸緩沖液（pH 8.3，含0.1%SDS），4×樣品緩沖液（100 mmol/L TrisHCl 緩沖液、20%甘油、4%SDS、200 mmol/L β巰基乙醇、0.2%溴酚藍(lán)），染色液為0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250甲醇-冰醋酸（9∶9∶2，V/V/V）;脫色液為水-甲醇-冰醋酸（8∶1∶1，V/V/V）。取PSC 1 mg溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中，調(diào)節(jié)pH為中性，加入樣品緩沖液，沸水浴煮沸5 min，5 000 r/min離心5 min取20 μl上樣。采用直流恒壓電源，電壓為100 V，凝膠成像系統(tǒng)分析^[6-7]。

1.4.3 氨基酸分析。

參照GB/T5009.1242003的方法，精確稱取10 mgPSC，使用日立83550型氨基酸自動分析儀對其主要氨基酸組成進(jìn)行分析。

1.4.4 紅外光譜分析。

利用膠原蛋白肽鍵中分子結(jié)構(gòu)與紅外吸收帶的波長位置與吸收譜帶的吸收強(qiáng)度相對應(yīng)的特點(diǎn)，采用傅立葉變換紅外光譜對凍干的膠原蛋白進(jìn)行投射掃描。參照GB/T60402002的方法，在紅外燈照射下將適量樣品和KBr混勻研成粉末狀。取樣品壓片，將樣品放入樣品室。用傅立葉變換紅外光譜儀在400～4 000 cm^-1區(qū)間掃描，分辨率設(shè)置為2 cm^-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDSPAGE電泳分析 從圖1可以看出，提取的PSC的電泳圖由α、β、γ 3條鏈組成，與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致^[8]。α₁鏈的分子量約為150 kD，未見α₂鏈，因此PSC分子組成可能為（α₁）₃。β、γ鏈的分子量在250 kD以上。

注：A.次高分子量標(biāo)準(zhǔn);B.海參PSC。

圖1 海參膠原蛋白的SDSPAGE電泳圖譜

2.2 氨基酸分析

由表1可知，PSC所含氨基酸種類齊全，具有典型膠原蛋白的組成。氨基酸總量達(dá)PSC的33.07%。其中，必需氨基酸總量達(dá)PSC的5.29%，占氨基酸總量的16%;鮮味氨基酸總量達(dá)PSC的19.04%;藥效氨基酸總量達(dá)PSC的17.69%，結(jié)果表明海參膠原在醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)上具有一定的營養(yǎng)價值。在氨基酸中Gly含量最高，約占氨基酸總量的1/5;Glu、Ala、Pro和Asp含量較高，而Met、Tyr和Val含量較低，但未檢測到Trp和Cys。PSC的亞氨基酸（脯氨酸+羥脯氨酸）含量為6.14%，羥脯氨酸與脯氨酸之比約為0.8，二者符合水產(chǎn)膠原蛋白的特征^[9]。氨基酸的這種組成形式，表明膠原蛋白為海參蛋白的主要組成成分。

Hyp是膠原蛋白的特征氨基酸，一般通過測定其含量可確定膠原蛋白的含量^[10]。從表1可以看出，提取的PSC中Hyp含量較低，這可能是由于海參皮中含有較多即原纖維蛋白和肌漿蛋白，且大部分為堿性蛋白^[4]。由于酶法提取破壞了膠原蛋白的空間結(jié)構(gòu)，提高了膠原蛋白得率的同時也造成了肌原纖維蛋白和肌漿蛋白的溶出，影響了所提取的膠原蛋白的純度。此外，由于胃蛋白酶和酸溶液的影響，在提取過程中可能造成膠原蛋白分子一定程度上的降解。

表1 PSC的氨基酸組成

氨基酸種類膠原蛋白

含量∥%氨基酸種類膠原蛋白

含量∥%

天冬氨酸Asp²，32.86 苯丙氨酸Phe¹，30.64

蘇氨酸Thr¹1.65 賴氨酸Lys¹，30.99

絲氨酸Ser1.17組氨酸His1.28

谷氨酸Glu²，34.51精氨酸Arg²，32.49

甘氨酸Gly²，36.01脯氨酸Pro3.31

丙氨酸Ala²3.17羥脯氨酸Hyp2.83

纈氨酸Val¹0.79必需氨基酸總量5.29

蛋氨酸Met¹，30.04鮮味氨基酸19.04

異亮氨酸Ile¹0.44藥效氨基酸總量17.69

亮氨酸Leu¹0.74氨基酸總量33.07

酪氨酸Tyr³0.15

注：1.必需氨基酸;2.鮮味氨基酸;3.藥效氨基酸。

2.3 紅外光譜分析

從圖2可以看出，PSC的酰胺A吸收峰為3 464 cm^-1，酰胺B吸收峰在2 924 cm^-1，酰胺Ⅰ帶的吸收峰為1 647 cm^-1。酰胺Ⅰ帶的特征吸收波數(shù)通常在1 630～1 680 cm^-1，是由蛋白質(zhì)多肽骨架的C=O伸縮振動產(chǎn)生，為蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的敏感區(qū)，常被用于蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)分析^[11]。該研究中提取的PSC符合酰胺Ⅰ帶的出峰位置。膠原蛋白酰胺Ⅱ帶的吸收在1 500～1 600 cm^-1，該研究中PSC酰胺Ⅱ帶的吸收頻率為1 552 cm^-1。PSC在1 212 cm^-1（酰胺Ⅲ帶）和1 458 cm^-1均有吸收，表明海參膠原蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)保持較好^[12]。紅外譜圖分析結(jié)果表明在提取過程中胃蛋白酶僅水解膠原的非螺旋區(qū)，對螺旋區(qū)沒有破壞。

圖2 PSC的紅外掃描圖譜

3 小結(jié)

從海參中提取膠原蛋白及其水解物的方法有酸法、堿法、酶法、酸與酶的結(jié)合、堿與酶的結(jié)合。酸解法通常需要0.1 mol/L醋酸長時間浸泡，溶解量少，與胃蛋白酶聯(lián)合使用，能提高溶解量，且蛋白酶水解膠原作用條件溫和，所需設(shè)備簡單，反應(yīng)速率快，提取的水解膠原蛋白純度高，水溶性好，理化性質(zhì)穩(wěn)定，所以該試驗(yàn)用堿、酶結(jié)合法提取蛋白質(zhì)。

經(jīng)胃蛋白酶消化法從海參中提取膠原蛋白，通過SDSPAGE電泳分析、氨基酸分析和紅外譜圖分析，所提取物為膠原蛋白，與文獻(xiàn)報道相一致。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉昌衡，王小軍，袁文鵬，等.復(fù)方海參口服液的抗疲勞和免疫功能的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（10）：1115-1119.

[2] 肖楓，曾名勇，董士遠(yuǎn)，等.海參膠原蛋白的研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科學(xué)，2005（6）：39-41.

[3] 畢琳.刺參（Stichopus japonicus）體壁膠原蛋白理化性質(zhì)和生物活性研究[D].青島：中國海洋大學(xué)，2006：12-13.

[4] 陶宇，李志皓，侯虎，等.不同方法提取沙海蜇皮膠原蛋白的對比分析[J].食品工業(yè)科技，2012，33（14）：310-311.

[5] 葉繼鋒，陳秀美，戴偉偉，等.海參膠原蛋白的提取及其基本成分的分析[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2011，28（6）：3195-3199.

[6] YAN M，LI B，ZHAO X，et al.Characterization of acidsoluble collagen

from the skin of walleye pollock（Theragra chalcogramma）[J].Food Chemistry，2008，107（4）：1581-1586.

[7] LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 [J].Nature，1970，227：680-685.

[8] 崔鳳霞，薛長湖，李兆杰，等.仿刺參膠原蛋白的提取及理化性質(zhì)[J].水產(chǎn)學(xué)報，2006，30（4）：549-553.

[9] CUI F X，XUE C H，LI Z J，et al.Characterization and subunit composition of collagen from the body wall of sea cucumber Stichopus japonicus [J].Food Chem，2007，100：1120-1125.

[10] 蔣挺大.膠原與膠原蛋白[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[11] 侯虎，孫江，毛家楠，等.海參膠原纖維形態(tài)及膠原蛋白理化性質(zhì)研究[J].現(xiàn)代食品科技，2013，29（7）：1493-1494.

[12] 段蕊，張俊杰，陳玲，等.鯉魚魚皮和魚骨酶溶性膠原蛋白的性質(zhì)比較[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（5）：10-13.