李博，謝樹蓮

（1.太原師范學院 地理科學學院，山西 太原 030012；2.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006）

地衣中共生藻的光合作用為地衣體制造有機營養(yǎng)，而共生菌則吸收環(huán)境中的水分和無機鹽為共生藻的光合作用提供原料。目前已報道的地衣共生藻約有40屬120種，主要分布于是藍藻和綠藻。Honegger［1］指出地衣共生藻在受到外界環(huán)境劇烈變化時（如低溫、干旱等），其原生質(zhì)體會大幅收縮，從而促使地衣體進入生理休眠狀態(tài)，反之，當外界環(huán)境有利于地衣體生長時，其生理活動也能迅速恢復。

植物在長期的進化過程中，逐漸產(chǎn)生了一系列適應(yīng)低溫變化以增強其抗寒性的能力。當植物遭受低溫傷害時，其自身會合成或分解形成一些小分子物質(zhì)，增加細胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持細胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，緩解或降低低溫所造成的傷害［2］。此外，低溫脅迫會影響活性氧的產(chǎn)生與清除，造成氧化脅迫，進而引起細胞膜脂過氧化、核苷酸損傷和蛋白質(zhì)變性等現(xiàn)象的發(fā)生，甚至導致細胞的死亡。超氧化物歧化酶（SOD）是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，維持活性氧在植物體內(nèi)的代謝平衡，減輕活性氧的對其的傷害［3－4］。丙二醛（MDA）是膜脂過氧化重要的產(chǎn)物，其含量的變化能間接反應(yīng)細胞膜系統(tǒng)的損傷和抗逆性。一般認為植物在低溫脅迫下可溶性蛋白和可溶性糖含量會有所上升，以修復低溫對植物細胞所帶來的損傷［5－7］。

本實驗以采于山西管涔山的殼假網(wǎng)衣（Porpidia crustulata）為材料，研究了其共生藻在不同培養(yǎng)溫度條件下，其SOD活力、MDA、可溶性糖和可溶性蛋白的含量，以期了解地衣共生藻對溫度變化的響應(yīng)，為今后從地衣體中篩選抗逆性的藻株提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

殼假網(wǎng)衣（Porpidia crustulata），采自山西寧武管涔山。憑證標本保存于山西大學植物標本館（SXU）。共生藻經(jīng)分離純化后保存于本實驗室，經(jīng)鑒定為小球藻屬植物（Chlorellasp.GC）［8－9］。

1.2 實驗方法

在250mL三角瓶中加入150mL已滅菌的BG11培養(yǎng)液（pH＝7.5），接種1mL藻液，Chlorellasp.GC的初始接種濃度分別為3.8×106個／mL。實驗設(shè)置6個溫度梯度，分別為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃，在人工氣候箱（上海博訊，BSG－300）中培養(yǎng)，每個溫度設(shè)置3個平行，光暗比12h∶12h，光照強度2000lx。

1.2.1 MDA 含量的測定

MDA含量采用南京建成生物工程公司MDA酶標法試劑盒測定。在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時分別取5mL藻液，在高速臺式冷凍離心機（TGL－16G－C，上海安亭）中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mLPBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細胞破碎儀（JY92－Ⅱ，寧波新芝）中進行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10min，3500r／min，4℃。取50μL上清液，加入1000μL工作液，混勻。95℃水浴20min，取出后冷卻。在530nm處，用多功能酶標儀（MD，SpectraMax－M5，美國）測吸光度。按照試劑盒說明書提供的計算公式計算。

1.2.2 SOD活力測定

SOD采用南京建成生物工程公司W(wǎng)ST－1法試劑盒測定。在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時分別取5mL藻液，在高速臺式冷凍離心機中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mL PBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細胞破碎儀中進行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10min，3500r／min，4℃。取20μL清液，加入20μL工作液，200μL底物應(yīng)用液。37℃恒溫培養(yǎng)箱（HPX－9052MBE，上海博訊）溫浴20min。在450nm處，用多功能酶標儀測吸光度。按照試劑盒說明書提供的計算公式計算。

1.2.3 可溶性糖含量測定

采用蒽酮法測定可溶性糖含量。吸取濃度為0、10、20、30、40、60、80μg／mL的標準葡萄糖液1mL，加蒽酮試劑4mL，各管快速搖勻后立即放入沸水浴10min。取出后冷卻，以空白作對照，用多功能酶標儀測定其在620nm波長下的吸光度。以吸光度為縱坐標，可溶性糖含量為橫坐標，繪制標準曲線。

在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時分別取5mL藻液在高速臺式冷凍離心機中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mL PBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細胞破碎儀中進行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10min，3500r／min，4℃。取200μL上清液，加入800μL蒽酮試劑沸水浴10min，取出后冷卻。在620nm處，用多功能酶標儀測其吸光度?？扇苄蕴呛浚?）＝（C×V總×D）／W×V測×106×100，式中：C由標準曲線所得的糖含量（μg），V總提取液總體積（mL），D稀釋倍數(shù)，W 樣品重量（g），V測吸取的提取液體積（mL）。

1.2.4 可溶性蛋白含量測定

可溶性蛋白含量使用南京建成生物工程公司蛋白定量測試試劑盒（考馬斯亮藍法）進行測定。在培養(yǎng)0、3、6、9、12d時分別取5mL藻液，在高速臺式冷凍離心機中離心15min，4500r／min，10℃，棄上清液，加入1mL PBS（pH7.2，0.05mol／L）。在細胞破碎儀中進行破碎，功率600W，工作8s，間隙5s，20min。冷凍離心10 min，3500r／min，4℃。取50μL上清液，加入3mL考馬斯亮藍應(yīng)用液，混勻，靜止10min后精確吸取250μL加入酶標板。在595nm處，用多功能酶標儀測吸光度。按照試劑盒說明書提供的計算公式進行計算。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，并用t－檢驗方法對回歸方程進行回歸顯著性檢驗；P＜0.05時，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對共生藻MDA含量的影響

由圖1可知，共生藻在5℃、10℃和15℃的低溫培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3d后，MDA含量迅速上升，之后，MDA含量又呈下降趨勢。0到3d的培養(yǎng)過程中MDA含量的迅速上升表明在5℃、10℃和15℃的低溫培養(yǎng)條件下，共生小球藻的細胞膜系統(tǒng)受到了損傷。培養(yǎng)3d后共生藻逐步適應(yīng)了低溫的生長環(huán)境，其MDA含量也回落。

Fig.1 Changes of MDA content of Chlorellasp.GC at different temperatures圖1 不同培養(yǎng)溫度下共生小球藻MDA含量變化

2.2 溫度對共生藻SOD活力的影響

在適宜的培養(yǎng)條件下，藻細胞內(nèi)的活性氧處于動態(tài)平衡。當藻細胞的生長受到外界環(huán)境影響時，其SOD活力的高低間接反映了機體清除活性氧自由基的能力。剛分離出的共生藻SOD活力遠高于經(jīng)過培養(yǎng)后的（圖2），這可能與其長期生活在寒冷的環(huán)境有關(guān)。培養(yǎng)3d后SOD活力整體呈下降趨勢，30℃培養(yǎng)條件下SOD活力最高，5℃到20℃培養(yǎng)條件下SOD活力逐漸升高，間接表明溫度的上升影響了共生藻細胞的生長。培養(yǎng)3d后SOD活力越來越低，這可能與其逐漸適應(yīng)培養(yǎng)條件和“地衣化”影響有關(guān)。為了更好地適應(yīng)共生關(guān)系，共生藻有著更強的活性氧自由基清除能力。

Fig.2 Changes of SOD activity of Chlorellasp.GC at different temperatures圖2 不同溫度培養(yǎng)條件下共生小球藻SOD活力變化

2.3 溫度對共生藻可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物細胞重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對細胞質(zhì)膠體和細胞液有重要的作用。一般認為，植物細胞可溶性糖含量的高低與其抗寒性呈正相關(guān)［7］。由圖3可知，共生藻初始可溶性糖含量較高。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加和共生藻擺脫“地衣化”而自由生活，可溶性糖含量逐步升高。5℃和10℃培養(yǎng)條件下，可溶性糖含量高于其他培養(yǎng)溫度，表明共生藻在低溫條件下加強了水解作用，將淀粉、蛋白質(zhì)等大分子化合物大量降解成可溶性糖，增加細胞液濃度，以調(diào)節(jié)細胞滲透壓，提高機體抗寒能力［10－11］。由此可見，共生藻對低溫有較好的耐受性。為了更好地適應(yīng)共生生活，共生藻可能逐漸建立起了適應(yīng)寒冷氣候的適應(yīng)機制。

Fig.3 Changers of soluble sugar contents of Chlorellasp.GC at different temperatures圖3 不同溫度培養(yǎng)條件下共生小球藻可溶性糖含量變化

Fig.4 Changers of soluble protein contents of Chlorellasp.GC at different temperatures圖4 不同溫度培養(yǎng)條件下共生小球藻可溶性蛋白質(zhì)含量變化

2.4 溫度對共生藻可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

植物細胞內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量與其抗寒性密切相關(guān)，可溶性蛋白質(zhì)含量的增加有利于提高植物體的抗寒性。從圖4可以看出，共生藻初始可溶性蛋白質(zhì)含量較少，這可能與其被“地衣化”影響和生長環(huán)境有關(guān)。隨著培養(yǎng)時間的增加，可溶性蛋白質(zhì)含量經(jīng)歷了先升高再降低，再升高的過程。5℃和10℃培養(yǎng)條件下的可溶性蛋白質(zhì)含量較其它培養(yǎng)溫度下更高，表現(xiàn)出具有較好的抗冷性。這可能與其長期生活在寒冷的氣候環(huán)境有關(guān)，在與地衣的共生中建立了適應(yīng)寒冷氣候的機制。

3 討論

據(jù)報道，低溫可降低植物細胞的代謝活力［12］，破壞細胞膜系統(tǒng)［13－16］，引起膜脂過氧化［17－19］，破壞活性氧代謝系統(tǒng)的平衡［20］，減弱呼吸作用，使細胞內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白含量增加［21－22］。本研究采用多項指標對殼假網(wǎng)衣共生藻對溫度變化的響應(yīng)進行了初步研究，結(jié)果顯示，在5℃和10℃的培養(yǎng)條件下，地衣共生藻MDA含量逐漸減少，可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量逐步增加，與有關(guān)文獻的結(jié)果相一致。

Thüs等［23］指出，自由生活的藻細胞在逐漸演變?yōu)榈匾鹿采寮毎倪^程中，其細胞結(jié)構(gòu)和生理特性會受到“地衣化”的影響而發(fā)生變化。本實驗中殼假網(wǎng)衣共生藻在與真菌體的長期互惠共生中，可能逐漸建立起了適應(yīng)管涔山地區(qū)寒冷氣候的機制，表現(xiàn)出較強的抗冷性。

由于地衣這一特殊的生物類群，生境要求嚴格，多數(shù)種類生長相對較慢。因此，目前關(guān)于地衣共生藻生理生化特性方面的研究還很少。但正是由于其特殊性，有些地衣共生藻具有抗逆性較強、營養(yǎng)物質(zhì)積累較多等特性，這也提示我們今后應(yīng)重視和加強對這一類群的深入研究，為篩選優(yōu)良藻種提供更多的途徑。

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