吳乙夫，董曉強

重組腺病毒介導(dǎo)的ING-4用于人MCF-7乳腺癌細胞的體外基因治療

吳乙夫，董曉強

作者單位:215006江蘇蘇州，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科

目的研究重組腺病毒介導(dǎo)的ING-4感染人MCF-7乳腺癌細胞后對其的生長抑制作用。方法將搭載有ING-4基因的重組腺病毒載體Ad-ING-4感染人MCF-7乳腺癌細胞，用熒光顯微鏡、RTPCR和Western-Blot法檢測ING-4在MCF-7細胞中的轉(zhuǎn)錄和表達;CCK法與流式細胞技術(shù)檢測ING-4基因?qū)CF-7細胞的生長抑制和促凋亡作用;半定量RT-PCR法檢測ING-4基因表達對MCF-7細胞中相關(guān)凋亡基因表達的影響。結(jié)果在MCF-7細胞中ING-4基因的表達對其細胞增殖有明顯抑制作用，并顯著促進其凋亡，ING-4表達使MCF-7細胞中Bax表達上調(diào)，Bcl-2、Survivin表達下調(diào)。結(jié)論MCF-7細胞在轉(zhuǎn)染ING-4基因后其增殖受到了明顯抑制，且更易凋亡，可能是通過改變Bax，Bcl-2及Survivin表達水平來實現(xiàn)。

ING-4基因;腺病毒載體;MCF-7人乳腺癌細胞;凋亡

乳腺癌在世界女性癌癥死因中占很高比率，在近幾十年里中國的乳腺癌發(fā)病率與病死率呈持續(xù)上升的趨勢［1］。化療一直是乳腺癌患者術(shù)后常規(guī)使用的治療方法之一，但化療后期經(jīng)常因腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生耐受而導(dǎo)致治療失敗。主要的原因可能是MDR-1基因的過度表達導(dǎo)致腫瘤細胞表面膜蛋白P-gp表達增加，從而促進胞內(nèi)的化療藥物外排［2］。腫瘤細胞的耐藥也與細胞的程序性死亡調(diào)控障礙有關(guān)，其常伴有促凋亡基因表達的降低與抗凋亡基因表達的升高［3］。ING為腫瘤生長抑制因子家族，其最早發(fā)現(xiàn)的成員有ING-1～ING-5，其抑癌作用與細胞周期調(diào)控、促進細胞凋亡、細胞DNA修復(fù)均有密切聯(lián)系，其中ING-4引起了人們越來越多的注意。大量研究已經(jīng)表明在各種不同類型的腫瘤細胞中均有ING-4基因的表達下調(diào)［4-7］、缺失［5，8］或突變［9-10］。在乳腺癌細胞中經(jīng)常出現(xiàn)ING-4的表達缺失，且ING-4能抑制IL-6、IL-8等促血管生成因子的生成，并且抑制NF-κB及缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的激活從而抑制腫瘤內(nèi)的血管生成。與此同時，ING-4對于腫瘤的增殖、遷移與侵襲亦有抑制作用。基于ING-4基因治療對人MCF-7乳腺癌細胞的抑癌效果尚未有人報導(dǎo)，在此項研究中，我們探索了ING-4表達水平與乳腺癌疾病進展的潛在聯(lián)系。根據(jù)隨后的實驗及所得數(shù)據(jù)評估ING4基因療法對乳腺癌細胞的抑癌效果同時推測其作用機制。

1　材料

重組腺病毒Ad-hING4-His（GFP+），空腺病毒Ad（GFP+）、QBI-293A細胞、MCF-7細胞均由本實驗室保存，DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone），小牛血清（杭州四季青），Taq DNA聚合酶、dNTPmix、DNA marker、Oligo（dT）18（TaKaRa），UNIQ柱式總RNA抽提試劑盒（上海生工生物技術(shù)有限公司），逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV（MBI），CCK-8（cell counting kit-8）（日本同仁化學(xué)研究所），羊源性抗人ING-4多克隆抗體，兔抗羊IgG HRP二抗（鈕英倫生物技術(shù)有限公司），蛋白印跡法化學(xué)發(fā)光試劑盒和暗盒（上海普利萊基因技術(shù)有限公司）。

2　方法

2.1Ad-ING-4作用后MCF-7人乳腺癌細胞形態(tài)學(xué)觀察將處于對數(shù)生長期的MCF-7細胞設(shè)為三組:實驗組（100 M的Ad-ING-4組）、空病毒對照組（100 M的Ad-GFP組）、陰性對照組（DMEM組）。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后在倒置顯微鏡及倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

2.2CCK-8法測定MCF-7細胞的多藥耐藥性按CCK-8試劑盒說明操作檢測不同濃度化療藥物對人乳腺癌細胞MCF-7的細胞毒作用，在96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入105個/ml細胞的單細胞懸液100 μl，培養(yǎng)24 h后，更換新的培養(yǎng)基，倍比稀釋加入不同濃度的藥物（阿霉素、5-Fu、環(huán)磷酰胺），每一種濃度重復(fù)5孔，對照組分別加入等體積的Ad-GFP和PBS，放置于37℃5%CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，更換培養(yǎng)基，每孔加入10 μl CCK-8繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm波長的各孔吸光度（obtical density OD）值。每組分別去除一個最大OD值和最小OD值，取剩下3個平行孔的平均OD值計算細胞抑制率。以藥物濃度為橫軸，細胞抑制率為縱軸，繪制濃度效應(yīng)曲線，求得半數(shù)抑制濃度（IC50）。實驗重復(fù)3次。

2.3RT-PCR檢測ING-4基因在MCF-7人乳腺癌細胞中的表達用100 M的Ad-ING-4和Ad-GFP病毒分別感染MCF-7細胞72 h后，收集細胞，PBS洗滌2～3次，按試劑盒說明書要求提取細胞總RNA，用引物ING-4-F、ING-4-R進行RT-PCR鑒定。PCR反應(yīng)條件為94℃4 min，94℃50 s，58℃50 s，72℃1 min，30循環(huán);72℃10 min，最后各取10 μl產(chǎn)物與DNA Marker一起行瓊脂糖凝膠電泳。

2.4RT-PCR法檢測MCF-7人乳腺癌細胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2、survivin的表達將呈對數(shù)生長的MCF-7細胞分為3組，實驗分組同2.1，處理方法同2.3，感染病毒72 h后按試劑盒說明步驟抽提細胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。將cDNA模板加入Bax上下游引物及Bcl-2上下游引物進行PCR反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)條件為94℃4 min，94℃50 s，56℃50 s，72℃1 min，30循環(huán)，72℃10 min，PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳。

表1　RT-PCR所用相關(guān)引物及其序列

2.5Western Blot檢測ING-4基因在MCF-7細胞中的蛋白表達按方法2.3確定的腺病毒合適感染劑量（100 M）感染MCF-7/ADR細胞，感染Ad-ING-4為實驗組，Ad-GFP和PBS為對照組。感染72 h后收集細胞，1 500 r/min，離心5 min收集細胞，PBS洗滌2～3次，各組細胞在裂解緩沖液中裂解。蛋白樣品在10%SDS-PAGE膠中電泳分離，再將凝膠蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別加入羊抗人ING-4抗體（1∶1 000），37℃2 h，然后加入HRP標記的兔抗羊IgG二抗，再用，TBST洗膜5 min×3次，最后加化學(xué)發(fā)光底物（ECL），保鮮膜包裹后，于暗室內(nèi)以ECL進行顯色。

2.6流式細胞技術(shù)檢測Ad-ING-4對MCF-7人乳腺癌細胞凋亡的影響根據(jù)2.2測出的IC50值作為加藥組的加藥量參考依據(jù)，將呈對數(shù)生長的MCF-7細胞分為6組:100 M Ad-ING-4加入半數(shù)抑制濃度的阿霉素（Ad-ING-4+ADR組）、100 M Ad-ING-4（Ad-ING-4組）、半數(shù)抑制濃度的阿霉素（ADR組）、100 M Ad-GFP（Ad-GFP組）、100 M Ad-GFP加入半數(shù)抑制濃度阿霉素（Ad-GFP+ADR組）、PBS陰性對照組。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)72 h后，分別收集6組細胞，PBS洗2遍細胞，按照凋亡試劑盒處理細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡，實驗重復(fù)3次。

2.7統(tǒng)計學(xué)方法對所取得的數(shù)據(jù)運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1Ad-ING-4在MCF-7細胞中的轉(zhuǎn)染感染Ad-ING-4腺病毒24 h、48 h、72 h的MCF-7細胞熒光圖見圖1，由圖1示，隨Ad-ING-4感染作用時間的延長，MCF-7細胞變圓、脫落、皺縮、聚集等現(xiàn)象愈加明顯，細胞貼壁數(shù)量明顯減少。

圖1　感染Ad-ING-4腺病毒24 h（A）、48 h（B）、72 h（C）的MCF-7細胞熒光圖（×200）

3.2Ad-ING-4對MCF-7細胞的化療多藥耐藥性的影響具體結(jié)果見圖2，實驗組（Ad-ING-4）對ADM、5-Fu及CTX的IC50值明顯低于對照組（Ad-GFP及PBS），有顯著差異（均P＜0.05），對照組間的IC50值無顯著差異（P＞0.05）。

圖2　Ad-ING-4對MCF-7細胞的化療多藥耐藥性的影響

圖3　Ad-ING-4感染后的MCF-7細胞的ING-4基因及凋亡相關(guān)的Bax、Bcl-2、Survivin基因表達的變化

3.3Ad-ING-4感染后的MCF-7細胞的ING-4基因及凋亡相關(guān)的Bax、Bcl-2、Survivin基因表達的變化

具體結(jié)果見圖3，Ad-ING-4感染MCF-7細胞72 h后，與空白對照組和Ad-GFP組相比，Ad-ING-4能使MCF-7細胞Bax的表達水平明顯上調(diào)（均P＜0.05），Bcl-2、Survivin的表達水平明顯下調(diào)（均P＜0.05），Bax/Bcl-2的比值顯著提高（均P＜0.05）。

3.4Ad-ING-4感染后的MCF-7細胞的ING-4基因相關(guān)蛋白的表達具體結(jié)果見圖4，Ad-ING-4感染MCF-7細胞72 h后，與空白對照組和Ad-GFP組相比，Ad-ING-4實驗組的ING-4蛋白表達水平有顯著差異（均P＜0.05）。

3.5Ad-ING-4對MCF-7細胞的凋亡率的影響具體結(jié)果見圖5，Ad-ING-4+ADM組、ADM組、Ad-GFP+ADM組、Ad-ING-4組的細胞凋亡率明顯高于PBS組及Ad-GFP組（均P＜0.05）;且Ad-ING-4+ ADM組的細胞凋亡率要高于Ad-ING-4組及ADR組（均P＜0.05）;而PBS組和Ad-GFP組的細胞凋亡率無明顯差異（P＞0.05）。

圖4　Ad-ING-4感染后的MCF-7細胞的ING-4基因相關(guān)蛋白的表達

圖5　Ad-ING-4對MCF-7細胞的凋亡率的影響

4　討論

乳腺癌嚴重危害廣大婦女健康。目前外科手術(shù)是乳腺癌的主要治療手段，而術(shù)后化療則是常規(guī)的后續(xù)治療方案之一。然而，化療效果并不是經(jīng)常令人滿意。傳統(tǒng)化療藥物的藥效往往因其嚴重的副作用而受到限制，而且腫瘤細胞也很容易產(chǎn)生耐藥。因此，尋找一個能夠改善化療療效的途徑這一訴求顯得迫切起來。

基因治療在2009年被SCIENCE雜志譽為“十項重大科學(xué)發(fā)現(xiàn)之一”。腫瘤基因治療是一種充滿光明前景的新型腫瘤治療方法。先前眾多的相關(guān)研究表明ING-4在促進腫瘤細胞凋亡、細胞接觸抑制、抑制腫瘤內(nèi)血管生成等抑制腫瘤生長的活動中發(fā)揮著重要作用。在人神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤中，ING-4可通過調(diào)節(jié)p53的乙?；癄顟B(tài)增強p53的轉(zhuǎn)錄活性，可通過與NF-κB（nuclear factor-kappaB）的P65（RELA）亞基相互作用抑制其轉(zhuǎn)錄活性，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長和腫瘤新血管的生成［4，11］。在人前列腺癌中，ING-4能夠抑制前列腺癌PC-3細胞增殖，同時上調(diào)p53、Bax和caspase-3的表達及下調(diào)bcl-2的表達，誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡［12］。通過上述研究，我們可以得出一個初步結(jié)論:ING4可能與腫瘤細胞的生長與侵襲有著密切的聯(lián)系。

在此項實驗中，我們用100M濃度的AdING4病毒于體外感染MCF-7人乳腺癌細胞，發(fā)現(xiàn)感染實驗組較之未感染對照組其細胞生長被明顯地抑制。ING4基因的表達能促使MCF-7細胞的Bax基因表達明顯上調(diào)，Bcl-2、Survivin基因表達明顯下調(diào)，進而誘導(dǎo)細胞凋亡。與此同時，ING4與化療藥物（阿霉素）聯(lián)合應(yīng)用后產(chǎn)生了更為明顯的協(xié)同效應(yīng)，進一步促進了腫瘤細胞的凋亡。

綜上所述，重組腺病毒介導(dǎo)的ING4能夠有效地抑制MCF-7人乳腺癌細胞的增殖并促進其凋亡，至于其引起腫瘤細胞凋亡的更多分子機制尚有待于進一步研究。在此項實驗中，我們發(fā)現(xiàn)ING4與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用后對腫瘤細胞產(chǎn)生了明顯的協(xié)同抑瘤效應(yīng)，這給我們提供了一條腫瘤臨床治療的新思路，同時為進一步在臨床上開展腫瘤基因治療創(chuàng)造了條件。

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Enhanced chemotherapy sensitization effect of recombinant ING-4 adenovirus on MCF-7 breast cancercells

WU Yifu，DONG Xiaoqiang.

（Department of General Surgery，The First Affiliated of Soochow Universi-ty，Suzhou 215006，China）

WU Yifu，E-mail:821381555@qq.com

ObjectiveTo explore the growth-inhibitory effects on the MCF-7 human breast cancer cells of the adenovirus-mediated ING-4 gene.MethodsThe MCF-7 human breast cancer cells were infected with Ad-ING-4.Fluorescence microscope，RT-PCR and Western-Blot analysis were selected to detect the transcription of ING-4 gene.Cell growth inhibition and apoptosis were detected by CCK-8 assay and flow cytometry.In addition，RT-PCR was selected to detect the expression of Bax and Bcl-2.ResultsThe cell-growth of MCF-7 cells infected by Ad-ING-4 were obviously inhibited，and the infected cells had a higher apoptosis rate.Expression of ING-4 had relationships with the up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2and Survivin. ConclusionsAdING4 can inhibit the growth of MCF-7 cells and induce cell apoptosis，which may result in changing Bax and Bcl-2 expression.

ING-4 gene;adenovirus vector;MCF-7 human breast cancer cell;apoptosis

吳乙夫，男，碩士研究生，研究方向:乳腺疾病的基礎(chǔ)研究，E-mail:821381555@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.01.011

1674-4136（2014）05-0040-04

2014-07-18］［本文編輯:劉嘉］