辛海榮，栗一帆，馬晉峰，高澤峰

GPC3蛋白在肝細(xì)胞肝癌及肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

辛海榮，栗一帆，馬晉峰，高澤峰

目的探討GPC3蛋白在肝細(xì)胞肝癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及結(jié)節(jié)性肝硬化組織中的表達(dá)差異及臨床意義。方法對(duì)50例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌、20例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及22例結(jié)節(jié)性肝硬化組織采用免疫組織化學(xué)法進(jìn)行GPC3蛋白表達(dá)情況檢測(cè)，比較分析其在三者中的表達(dá)差異。結(jié)果GPC3蛋白特異性表達(dá)于肝細(xì)胞肝癌，與其在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及結(jié)節(jié)樣肝硬化組織中的表達(dá)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。GPC3蛋白的在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)與患者的性別、年齡、肝功能分級(jí)、是否合并肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)、血管侵犯、TNM分期、HBsAg陽(yáng)性等方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論GPC3高表達(dá)于肝細(xì)胞肝癌組織中，可能參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。

肝細(xì)胞肝癌;肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌;結(jié)節(jié)性肝硬化;GPC3蛋白

磷脂酞肌醇蛋白聚糖3（GPC3）是1996年P(guān)ilia等在研究過(guò)度生長(zhǎng)綜合癥時(shí)發(fā)現(xiàn)的蛋白聚糖家族成員，是一種膜性硫酸乙酞肝素蛋白多糖，通過(guò)磷脂酞肌醇錨定在細(xì)胞膜上，能夠調(diào)節(jié)不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，進(jìn)而在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育和惡變過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。GPC3在人體胚胎、胎盤(pán)等組織中高表達(dá)，但在正常成人肝臟中無(wú)表達(dá)。最近文獻(xiàn)相繼報(bào)道了GPC3在HCC組織中高表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率70%～90%，提示GPC3對(duì)肝癌診斷有顯著的靈敏性和特異性，可能成為新的標(biāo)志物。

1　資料和方法

1.1標(biāo)本來(lái)源及處理收集2004年5月至2008年1月我院經(jīng)手術(shù)切除的50例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌、20例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及22例結(jié)節(jié)性肝硬化組織標(biāo)本，參照美國(guó)肝病學(xué)會(huì)-巴塞羅那（AASLDBCLC）分期標(biāo)準(zhǔn)和治療策略進(jìn)行臨床和病理診斷，50例原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌，按照BCLC分期分為:極早期5例，早期12例，中期18例，進(jìn)展期15例;20例肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌，亦按BCLC分期分為:極早期1例，早期3例，中期8例，進(jìn)展期8例。以上病例血清HIV、梅毒等病毒標(biāo)志物均為陰性，所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色。所有標(biāo)本取材均通過(guò)我院倫理委員會(huì)審核，家屬知情同意并簽字。標(biāo)本保存于液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存。

1.2試劑與儀器SP法免疫組化染色試劑盒（購(gòu)于美國(guó)ZYMED公司，由國(guó)內(nèi)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司代理），鼠抗人Glypican-3單克隆抗體（工作濃度1∶100，購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司）。儀器包括:LEICA RM2135切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.3方法免疫組化二步法:免疫組化SP法參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行（4 μm石蠟切片脫蠟至水。高壓熱抗原修復(fù)，PBS沖洗，每張切片滴加一滴過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。后經(jīng)非免疫動(dòng)物血清封閉，滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記的第二抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的卵白素，室溫下各孵育10 min）。DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的判斷:隨機(jī)取5個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞為基數(shù)，按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例的平均數(shù)為評(píng)定陽(yáng)性的依據(jù)，分為細(xì)胞無(wú)染色或陽(yáng)性細(xì)胞＜5%為陰性（-），陽(yáng)性細(xì)胞占5%～25%為弱陽(yáng)性（+），陽(yáng)性細(xì)胞占26%～50%為中陽(yáng)性（++），陽(yáng)性細(xì)胞＞50%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++），每批染色的陽(yáng)性對(duì)照片應(yīng)顯示陽(yáng)性，陰性對(duì)照片應(yīng)顯示為陰性，否則整批片重染。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，比較表達(dá)是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1GPC3在肝細(xì)胞肝癌、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及結(jié)節(jié)性肝硬化組織中的表達(dá)GPC3蛋白主要表達(dá)在肝細(xì)胞癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中（圖1、2），GPC3在肝細(xì)胞肝癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為84.0%，其中強(qiáng)陽(yáng)性26例，中陽(yáng)性10例，弱陽(yáng)性6例。GPC3主要表達(dá)在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中（圖3），GPC3在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌中表達(dá)陽(yáng)性率為10.0%，均為弱陽(yáng)性。與在肝細(xì)胞肝癌中的陽(yáng)性表達(dá)相比，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.07，P＜0.05）。22例結(jié)節(jié)性肝硬化標(biāo)本中，GPC3蛋白均為陰性。

2.2GPC3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，結(jié)果表明，GPC3蛋白的在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)與患者性別、年齡、肝功能分級(jí)、是否合并肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個(gè)數(shù)、血管侵犯、TNM分期、HBsAg陽(yáng)性等方面的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表1　GPC3蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3　討論

GPC3蛋白是位于細(xì)胞膜表面的一種多糖蛋白，為IGF2等細(xì)胞因子的共同受體，其由核心蛋白和糖胺聚糖側(cè)鏈構(gòu)成，通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子和蛋白酶等的相互作用傳遞信號(hào)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和遷移中發(fā)揮重要功能［1］。近年來(lái)GPC3作為一種新的肝細(xì)胞癌標(biāo)記物逐漸引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。GPC3能通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定于細(xì)胞膜上，并通過(guò)結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子和蛋白酶等參與調(diào)節(jié)腫瘤的細(xì)胞增殖、分化、黏附和轉(zhuǎn)移等，與肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系［2-3］。1997年Hsu等［4］首次報(bào)道了GPC3 mRNA在肝癌組織中高表達(dá)。隨后越來(lái)越多的研究者證實(shí)，GPC3在肝癌中有特異性高表達(dá)，而在癌旁組織、肝硬化、肝炎組織、成人正常肝組織低表達(dá)或不表達(dá)，因而被認(rèn)為其是原發(fā)性肝癌的一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物。

GPC3成為診斷原發(fā)性肝癌，尤其是對(duì)早期肝癌的診斷特異性高正在被越來(lái)越多的學(xué)者所共識(shí)，并且對(duì)鑒別肝臟良性病變有著重要意義。Wang等［6］將手術(shù)切除的肝臟標(biāo)本進(jìn)行GPC3單克隆抗體免疫組化染色，其中包括111例原發(fā)性肝癌，48例肝細(xì)胞腺瘤，30例局灶性結(jié)節(jié)性增生，32例結(jié)節(jié)性肝硬化患者。結(jié)果顯示111例原發(fā)性肝癌中有84例GPC3陽(yáng)性染色，84例中有61例表現(xiàn)為彌漫性的免疫反應(yīng)。肝細(xì)胞腺瘤、局灶性結(jié)節(jié)性增生、結(jié)節(jié)性肝硬化顯示沒(méi)有檢測(cè)到GPC3陽(yáng)性染色。原發(fā)性肝癌中GPC3的表達(dá)與腫瘤的大小、分化、階段肝硬化背景存在或不存在、相關(guān)病因無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。葉玉清等［7］通過(guò)對(duì)肝細(xì)胞癌357例、膽管癌26例、肝細(xì)胞癌癌旁肝組織包括肝硬化171例、血管瘤旁肝組織93例、肝轉(zhuǎn)移癌84例，采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)GPC3蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示72.0%的肝細(xì)胞癌GPC3呈陽(yáng)性反應(yīng)，其余374例非肝細(xì)胞癌病例均為陰性，包括膽管癌、肝轉(zhuǎn)移癌、肝細(xì)胞癌癌旁肝組織（包括肝硬化和血管瘤旁肝組織）。GPC3陽(yáng)性率在不同的肝細(xì)胞癌組織學(xué)分級(jí)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。Honsová等［8］通過(guò)對(duì)138例肝活檢標(biāo)本GPC3表達(dá)研究，包括86例肝癌、肝10例細(xì)胞腺瘤、12例局灶性結(jié)節(jié)性增生，25例無(wú)腫瘤的肝硬化、5例神經(jīng)內(nèi)分泌癌肝轉(zhuǎn)移患者。結(jié)果顯示，93%肝癌染色呈陽(yáng)性，GPC3的表達(dá)與肝癌的分期、大小無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，所有良性結(jié)節(jié)性病變、肝硬化非腫瘤病變GPC3的表達(dá)陰性。Wang等［9］通過(guò)54例原發(fā)性肝癌及其癌旁肝組織（21例肝硬化發(fā)展的肝癌和33例正常肝發(fā)展的肝癌）和94例肝硬化腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行GPC3免疫組化，21例肝硬化發(fā)展的肝癌中19例GPC3陽(yáng)性染色，33例正常肝發(fā)展的肝癌中18例GPC3陽(yáng)性染色，1例非腫瘤癌旁組織GPC3陽(yáng)性染色，94例肝硬化腫瘤結(jié)節(jié)中，48%重度異型增生或早期原發(fā)性肝癌GPC3陽(yáng)性染色，3%良性或低度不典型增生的腫瘤結(jié)節(jié)GPC3陽(yáng)性染色，結(jié)果表明，GPC3是一種有效的肝癌診斷指標(biāo)，潛在有用的肝細(xì)胞腺瘤和分化以及肝癌的鑒別診斷，GPC3可能被視為肝癌發(fā)生的早期標(biāo)志物，能夠識(shí)別惡性潛能的某些肝硬化結(jié)節(jié)。

最近研究表明，GPC3在原發(fā)性肝癌中表達(dá)成為影響肝癌患者預(yù)后和復(fù)發(fā)的潛在指標(biāo)。Ning等［10］通過(guò)對(duì)61例原發(fā)性肝癌患者的免疫組化分析決定GPC3的表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系，通過(guò)比較GPC3表達(dá)高低預(yù)測(cè)肝癌患者的生存時(shí)間。高GPC3的表達(dá)在肝癌患者手術(shù)后轉(zhuǎn)移/復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加至3.214（相比低GPC3表達(dá)的HCC患者）。生存分析表明，肝癌患者高表達(dá)GPC3比肝癌患者低表達(dá)GPC3生存時(shí)間縮短（P=0.003）。此外，多變量分析表明GPC3表達(dá)對(duì)原發(fā)性肝癌患者是一個(gè)顯著、獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)（P=0.030）。Shirakawa等［11］通過(guò)對(duì)107例原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本分析，高分化好肝癌組織中比在中、低分化肝癌組織GPC3的表達(dá)降低，差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上意義。本研究也表明GPC3表達(dá)與原發(fā)性肝癌患者的預(yù)后不良相關(guān)。

膽管細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的病理分型中較少見(jiàn)的一種，由于其癥狀隱匿、不典型，早期臨床表現(xiàn)多不明顯，故確診時(shí)往往已經(jīng)處于晚期。目前無(wú)特異性腫瘤標(biāo)志物對(duì)膽管細(xì)胞癌早期診斷起到提示作用。Man等［12］通過(guò)GPC3的表達(dá)在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、膽囊癌、肝癌進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，檢測(cè)GPC3的表達(dá)水平。結(jié)果顯示肝癌組織中GPC3的表達(dá)升高超過(guò)2倍高于癌旁組織，而21例膽管細(xì)胞癌患者，只有4例GPC3在腫瘤組織中的表達(dá)上調(diào)2倍高于癌旁組織。結(jié)果證明，GPC3可以作為一種生物標(biāo)志物的鑒別診斷肝細(xì)胞肝癌和肝內(nèi)膽管癌。Lagana等［13］通過(guò)41例膽管細(xì)胞癌、24例轉(zhuǎn)移性肝腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色，無(wú)1例膽管細(xì)胞癌GPC3表達(dá)陽(yáng)性，8%轉(zhuǎn)移性肝腫瘤組織GPC3表達(dá)陽(yáng)性。

綜上所述，GPC-3及其mRNA在HCC組織中的表達(dá)增加，特異性較高，具有早期診斷價(jià)值。采用靈敏度高，特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)技術(shù)去探測(cè)患者肝癌發(fā)生相關(guān)基因標(biāo)志，并結(jié)合癌細(xì)胞表達(dá)的特異性蛋白檢測(cè)，可早期診斷肝癌、監(jiān)測(cè)肝癌發(fā)生、術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。單克隆抗體能夠特異性的識(shí)別GPC-3，證實(shí)來(lái)其可能是一種有希望的早期診斷肝癌的癌胚胎性蛋白，同樣也可能基于單克隆抗體基礎(chǔ)上開(kāi)辟新的靶向治療。

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Expression of GPC3 protein in bile duct in hepatocellular carcinoma and hepatic cell carcinoma

XINHairong，LI Yifan，MA Jinfeng，et al.

（Department of General Sugery，Shanxi Province Tumour Hospital，030013 Taiyuan，China）

XIN Hairong，E-mail:xhrzyy@126.com

ObjectiveTo investigate the expression of GPC3 in bile duct in hepatocellular carcinoma，intrahepatic cholangiocarcinoma，and to compare GPC3 expression difference of bile duct in hepatocellular carcinoma，hepatic cell carcinoma，nodular cirrhosis.Methods50 cases of primary hepatocellular carcinoma，20 cases of intrahepatic cholangiocarcinoma，22 cases of nodular cirrhosis，immunohistochemistry method were used to detect GPC3 expression，difference of bile duct in hepatocellular carcinoma，intrahepatic cholangiocarcinoma，nodular cirrhosis of the liver in GPC3.Resultsthe GPC3 specific expression in hepatocellular carcinoma，the expression of sensitivity and specificity were 84%，97.7%，compared with the expression of GPC3 in intrahepatic cholangiocarcinoma，nodular cirrhosis，the difference was statistically significant（P＜0.05）. GPC3 protein expression in hepatocellular carcinoma associated with gender，age，liver function classification，cirrhosis，tumor size，tumor number，vascular invasion，TNM staging，HBsAg positive aspects of the difference was not statistically significant（P＞0.05）.ConclusionsThe high expression of GPC3 in hepatocellular carcinoma tissues，there may be involved in the development of hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma;intrahepatic cholangiocarcinoma;cirrhosis;GPC3 protein

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（項(xiàng)目編號(hào):B2007134）

作者單位:030013山西太原，山西省腫瘤醫(yī)院普外二科

辛海榮，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，擅長(zhǎng)肝、膽、胃、腸、胰腺及腹膜后腫瘤等疾病的診治，E-mail:xhrzyy@126.com通訊作者:楊熙鴻，男，廣東人，主任醫(yī)師，研究方向:頭頸部腫瘤的綜合治療，E-mail:yxihong@21cn.com

10.3969/j.issn.1674-4136.2015.01.010

1674-4136（2014）06-0036-04

2014-05-05］［本文編輯:劉嘉］