李衛(wèi)平，鄒龍，王連平，劉紅宇

（1.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南岳陽(yáng)414000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

多指標(biāo)正交試驗(yàn)法優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝*

李衛(wèi)平1，鄒龍2，王連平2，劉紅宇3

（1.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南岳陽(yáng)414000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410208）

目的優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝。方法以馬錢(qián)苷、丹酚酸B的含量及浸膏得率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3個(gè)因素對(duì)提取工藝的影響。結(jié)果最佳提取工藝為加（10，10，10）倍量水，提取3次，每次提取時(shí)間為90min。結(jié)論優(yōu)選的水提取工藝穩(wěn)定、可行。

正交試驗(yàn)法；滋陰明目片；提取工藝

滋陰明目丸由黃精、山茱萸、熟地、牡丹皮、丹參、淮山、菟絲子、牛膝、當(dāng)歸、石決明、三七、枸杞、茯苓、羌活、川芎、石菖蒲、楮實(shí)子17味中藥組方，具有滋陰、活血、利水的功效，對(duì)原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性、視神經(jīng)萎縮、黃斑變性等難治性眼疾療效顯著。擬將滋陰明目丸劑型改為片劑，以更好地適應(yīng)患者需求［1-3］?，F(xiàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，以馬錢(qián)苷、丹酚酸B的含量和浸膏得率為考察指標(biāo)優(yōu)選提取工藝，為片劑標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器與試藥

FE102型微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHG101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鞏義市英峪予華儀器廠）；TP214型分析天平（南京庚辰科學(xué)儀器有限公司）；Agilent1100型高效液相色譜系統(tǒng)（安捷倫科技有限公司）；AR2140型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）。丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為MUST-12020104，純度≥98%）；馬錢(qián)苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為111640-200604，純度≥98%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。山茱萸、黃精等17味藥材均購(gòu)于長(zhǎng)沙醫(yī)藥公司，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)鄒龍教授鑒定，符合2010年版《中國(guó)藥典（一部）》規(guī)定。

2　方法與結(jié)果

2.1丹酚酸B與馬錢(qián)苷含量測(cè)定［4-7］

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

丹酚酸B：色譜柱為KromasilODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-1.67%甲酸水（24∶10∶66）；檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm；流速為1.0mL/min。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1　丹酚酸高效液相色譜圖

馬錢(qián)苷：色譜柱為KromasilODS柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為水-乙腈（90∶10）；柱溫為25℃；流速為1.0mL/min；進(jìn)樣量為10μL。理論板數(shù)按馬錢(qián)苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖2。

2.1.2溶液制備

圖2　馬錢(qián)苷高效液相色譜圖

分別精密稱取干燥至恒重的對(duì)照品丹酚酸B 0.006 0 g和馬錢(qián)苷0.004 2 g，置50 mL容量瓶中，加80%甲醇溶解、定容，分別制得0.12 g/L的丹酚酸B對(duì)照品溶液和0.084 g/L的馬錢(qián)苷對(duì)照品溶液［8］。稱取浸膏粉適量，置具塞錐形瓶中，加入80%甲醇50mL，稱重，超聲溶解后再次稱重，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即為供試品溶液。分別取缺丹參的其余藥味、缺山茱萸的其余藥味，按正交試驗(yàn)的優(yōu)化工藝分別制成缺丹參和缺山茱萸的陰性樣品，按對(duì)照品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液［9］。

2.1.3方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：取缺丹參的陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液在丹酚酸B對(duì)應(yīng)色譜峰（主峰保留時(shí)間為11.73min）處無(wú)相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明方中其他藥味對(duì)丹酚酸B的測(cè)定無(wú)干擾。取缺山茱萸的陰性對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液在馬錢(qián)苷對(duì)應(yīng)色譜峰（主峰保留時(shí)間為19.74min）處無(wú)相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明方中其他藥味對(duì)馬錢(qián)苷的測(cè)定無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察：精密吸取丹酚酸B對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2.0，4.0，6.0，8.0，10.0μL，測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=1 035.6 X-20.733，r=0.999 9（n=5）。結(jié)果表明，丹酚酸B進(jìn)樣量在0.24～1.20μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。精密吸取0.084g/L馬錢(qián)苷對(duì)照品溶液4，6，8，10，20μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=2 117.5X-10.638，r=0.999 5（n=5）。結(jié)果表明，馬錢(qián)苷進(jìn)樣量在0.336～1.68μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的RSD為1.68%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取批號(hào)為20121022的樣品，平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果丹酚酸B含量的RSD為1.56%（n=6），馬錢(qián)苷含量的RSD為1.66%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取批號(hào)為20121022的樣品6份，加入丹酚酸B對(duì)照品適量，依法測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.90%，RSD為1.16%（n=6）；精密稱取批號(hào)為20120922樣品6份，加入馬錢(qián)苷對(duì)照品適量，依法測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為99.55%，RSD為0.71%（n=6）。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，1，3，6，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果丹酚酸B、馬錢(qián)苷峰面積的RSD分別為1.88%和1.46%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2浸膏得率測(cè)定

按處方比例稱取藥材9份，每份17味藥材，單劑合計(jì)135 g，用水回流提取，合并提取液，離心抽濾，濃縮，85%乙醇醇沉，過(guò)濾，濃縮干燥，在65℃真空干燥箱中干燥，稱重，計(jì)算浸膏得率。2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

經(jīng)預(yù)試驗(yàn)摸索得知，加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)產(chǎn)品收率影響大，選取加水量（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，采用L9（34）正交表對(duì)工藝進(jìn)行考察。因素水平表見(jiàn)表1。

根據(jù)組方藥材有效部位（成分）主要以水溶性為主，故將方中藥材用水回流提取，醇沉，濃縮干燥成浸膏，測(cè)定浸膏中丹酚酸B、馬錢(qián)苷的含量，采用加權(quán)綜合評(píng)分法優(yōu)選最佳提取工藝［10-11］。

從100mL提取液中精密移取適量，過(guò)0.45μm微孔濾膜，置入高效液相色譜系統(tǒng)，依法測(cè)定，記錄峰面積，測(cè)定丹酚酸B和馬錢(qián)苷的含量，并計(jì)算丹酚酸B和馬錢(qián)苷的提取率，結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)加權(quán)分析的結(jié)果采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2可見(jiàn)，R值反映加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)3因素的主次位置為C＞B＞A，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞加水量。表3中的加權(quán)結(jié)果顯示，PC＜0.05，PA，PB＞0.05，只有提取次數(shù)（C）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)表2中浸膏得率、丹酚酸B提取率、馬錢(qián)苷提取率及綜合評(píng)分4項(xiàng)指標(biāo)的K值大小，得知A2B3C3為最佳工藝條件，即加10倍量水、提取3次、每次90min。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱取藥材3份，以A2B3C3為條件，平行試驗(yàn)3次，分別測(cè)定浸膏得率、丹酚酸B和馬錢(qián)苷提取率，加權(quán)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明，浸膏得率、丹酚酸B提取率、馬錢(qián)苷提取率3次試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定且綜合評(píng)分較高，與正交試驗(yàn)結(jié)果一致，正交優(yōu)選的工藝條件穩(wěn)定。

表1　因素水平表

3　討論

滋陰明目丸使用已達(dá)20余年，針對(duì)視神經(jīng)萎縮、黃斑變性等多種難治目疾療效確切，安全可靠，值得深入研究。本試驗(yàn)運(yùn)用多指標(biāo)正交設(shè)計(jì)法，采用2010年版《中國(guó)藥典（一部）》馬錢(qián)苷、丹酚酸B的含量測(cè)定方法優(yōu)選滋陰明目片的提取工藝。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便快速，基線基本分離，雜質(zhì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品峰無(wú)干擾，可作為滋陰明目片提取工藝質(zhì)量控制的指標(biāo)。試驗(yàn)優(yōu)選的最佳工藝條件為，加10倍量水，每次90min，提取3次。

表2　L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n=3）

表3　加權(quán)綜合分?jǐn)?shù)方差分析表

表4　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

［1］龐惠萍，李起家，干性年齡相關(guān)性黃斑變性的治療時(shí)機(jī)探討［J］.中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2012，26（10）：127.

［2］劉志恒，炎癥與年齡相關(guān)性黃斑變性［J］.臨床眼科雜志，2012，20（3）：182.

［3］李波，張波濤，李傳課，等，滋陰明目丸治療濕性老年性黃斑變性的臨床觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)眼科雜志，2007，17（6）：311-312.

［4］楊小寧，唐星，柳玉石，等.丹參中總酚酸的分離純化工藝研究［J］.中草藥，2007，38（6）：843-846.

［5］謝靜，丹參水溶性成分提取工藝研究［J］.中國(guó)藥業(yè)，2009，18（3）：27-28.

［6］梁晉如，何姣，朱砂，等.山茱萸中莫諾苷和馬錢(qián)苷的藥理作用及提取分離方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理通訊，2011，29（4）：29.

［7］張燕，宋鵬飛.HPLC法測(cè)定清眩糖漿中馬錢(qián)苷的含量［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2012，28（4）：353-354.

［8］朱砂，梁晉如，何姣，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地及不同采收時(shí)間山茱萸中三個(gè)環(huán)烯醚萜苷的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（7）：1 235-1 238.

［9］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：26.

［10］郝延軍，趙曉笠，桑育黎，等，六味地黃丸對(duì)照提取液的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中草藥，2013，44（2）：180-182.

［11］賀娟妮，劉曉，牟朝麗，等.山茱萸中3種環(huán)烯醚萜苷的響應(yīng)曲面優(yōu)化微波提取及HPLC測(cè)定［J］.中藥材，2011，34（7）：1 118-1 122.

Optim ization of Ziyinm ingmu Tablets Extraction Process by M ulti-Index Orthogonal Experiment

Li Weiping1，Zou Long2，Wang Lianping2，Liu Hongyu3
（1.Yueyang Vocational Technical College，Yueyang，Hunan，China 414000；2.Hunan University of Chinese medicine，Changsha，Hunan，
China 410208；3.First Hospital of Hunan University of Chinese medicine，Changsha，Hunan，China 410208）

Objective To optimize the extract process of Ziyinmingmu Tablets.M ethod With the content and extraction rate of the loganin and salvianolic acid B as the comprehensive evaluation index，The orthogonal test of L9（34）was adopted to inspect the influence of volume of water，extract time and extract frequency on the extraction process.Result The best extraction process was adding（10，10，10）times amount water，and extracting 3 times with 90 minutes each time.Conclusion The optimal extraction process is stable and feasible.

orthogonal experiment；Ziyinmingmu Tablets；extraction process

TQ461；R284.1；R286.0

A

1006-4931（2015）16-0016-04

李衛(wèi)平（1975-），女，碩士研究生，副教授，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┕に嚺c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電子信箱）1307878066@ qq.com；劉紅宇，碩士研究生，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿┕に嚺c質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文通訊作者，（電子信箱）lhy9544@ 163.com。

2014-05-28；

2014-11-12）

*湖南省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)：201124。