杜亞茜，虞 泓，葛 鋒，*，劉迪秋，陳朝銀

（1.昆明理工大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2.云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650091）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲提取蘭坪被毛孢多糖和D-甘露醇

杜亞茜1，虞 泓2，葛 鋒1，*，劉迪秋1，陳朝銀1

（1.昆明理工大學(xué)，生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明650500；2.云南大學(xué)中草藥生物資源研究所云百草實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650091）

以蘭坪蟲(chóng)草無(wú)性型（蘭坪被毛孢）固體發(fā)酵產(chǎn)物為材料，以水為提取溶劑，在常溫條件下利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化蟲(chóng)草多糖和D-甘露醇的超聲提取綜合工藝。在超聲常溫水提的單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)一步考察液固比、超聲時(shí)間、超聲功率對(duì)蟲(chóng)草多糖和D-甘露醇綜合提取率的影響，以?xún)?yōu)化提取工藝。實(shí)驗(yàn)得到較優(yōu)綜合提取工藝條件為：液固比43∶1mL/g，超聲時(shí)間為50min，超聲功率為56W。在該工藝條件下蟲(chóng)草多糖提取率為23.06%，D-甘露醇提取率為2.30%。

蘭坪蟲(chóng)草，蘭坪被毛孢，響應(yīng)面法，超聲提取

蘭坪蟲(chóng)草（Ophiocordyceps lanpingensis H.Yu& Z.H.Chen）主要分布于滇西北地區(qū)，是寄生于鉤蝠蛾和劍川鉤蝠蛾的一種蟲(chóng)草菌，屬于線(xiàn)蟲(chóng)草屬，與冬蟲(chóng)夏草親緣關(guān)系較近，而且有效成分的種類(lèi)和含量與冬蟲(chóng)夏草相似，開(kāi)發(fā)研究蘭坪蟲(chóng)草這對(duì)緩解冬蟲(chóng)夏草資源短缺問(wèn)題具有重要價(jià)值［1-2］。蘭坪蟲(chóng)草中含有蟲(chóng)草多糖、D-甘露醇等多種活性成分。研究［3-4］表明蟲(chóng)草多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、護(hù)腎、延緩衰老、提高免疫力，降血糖、血壓、血脂，保護(hù)心臟等多種功效。D-甘露醇可應(yīng)用于由不同原因引起的腦水腫、治療顱腦疾患、頑固心絞痛、消化系統(tǒng)疾病、急性腦梗塞、頑固性腹水等［5-6］。

現(xiàn)階段，對(duì)中藥材有效成分的提取方法包括：微波輔助提取、索氏提取、超聲提取等［7-8］，其中微波輔助提取與索氏提取會(huì)遇到溫度難控或提取溫度過(guò)高等問(wèn)題，這會(huì)使有效成分提取不完全或?qū)е掠行С煞址纸?，原料利用率不高，?dǎo)致中藥材資源的浪費(fèi)。因此研究中藥材活性成分在常溫下的綜合提取工藝具有重要的應(yīng)用價(jià)值，本文是采用低溫超聲提取多組分的工藝優(yōu)化研究。

響應(yīng)面分析法是優(yōu)化工藝條件的一種有效方法，可以確定一個(gè)或若干個(gè)變量與測(cè)試成分之間的關(guān)系，識(shí)別實(shí)驗(yàn)的影響因子及其交互過(guò)程的響應(yīng)，準(zhǔn)確地反應(yīng)因素之間的關(guān)系及響應(yīng)值［9-12］。本文以蘭坪蟲(chóng)草無(wú)性型［13］蘭坪被毛孢（Hirsutella lanpingensis H. Yu&Z.H.Chen）固體發(fā)酵產(chǎn)物為材料，以水為提取溶劑，在常溫條件下利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化蟲(chóng)草多糖和D-甘露醇的超聲提取的綜合工藝方面做了一定的研究，為蘭坪蟲(chóng)草的開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘭坪被毛孢 云南云百草生物技術(shù)有限公司［13］，本文采用固體發(fā)酵培養(yǎng)蘭坪被毛孢菌絲體［1］；苯酚、乙酸銨 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司（分析純）；濃硫酸、濃鹽酸 重慶川東化工有限公司（分析純）；高碘酸鉀 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所（分析純）；L-鼠李糖 Sigma；乙酰丙酮 Adamas Reagent Co.；實(shí)驗(yàn)用水 為去離子水。

XO-SM 100超聲微波組合反應(yīng)裝置 南京先歐儀器制造有限公司；HH-S水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Ultrospec 2100pro紫外分光光度計(jì)Amersham Biosciences；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖與D-甘露醇測(cè)定方法及提取率計(jì)算公式

蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定［14-15］：取約2m L適當(dāng)稀釋的樣品與1m L 5%苯酚溶液，混勻后加入7m L濃硫酸混勻。將混合物置于40℃水浴鍋中水浴30m in后，迅速冷卻至室溫?？瞻讓?duì)照以1m L的蒸餾水代替樣品，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值帶入多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算多糖含量。

D-甘露醇含量的測(cè)定［16-17］：取約1m L適當(dāng)稀釋的樣品與1m L高碘酸鉀溶液混合，在室溫中靜置10m in，加入2m L的1%L-鼠李糖溶液，混勻。加入4m L新鮮配制的NASH試劑（7.5g乙酸銨、100μL冰醋酸和100μL乙酰丙酮，用蒸餾水定容50m L）劇烈搖勻。將混合物置于53℃水浴鍋中水浴15m in后，迅速冷卻至室溫?？瞻讓?duì)照用蒸餾水代替樣品，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在412nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值帶入D-甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算D-甘露醇含量。

提取率計(jì)算公式：

式中，Xi為多糖/D-甘露醇含量（mg）；X為樣品干重（g）；Yi為多糖/D-甘露醇提取率。

1.2.2 超聲提取單因素實(shí)驗(yàn) 固定超聲時(shí)間30m in、超聲功率30W的條件，考察液固比分別為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1m L/g時(shí)對(duì)蘭坪被毛孢中多糖及D-甘露醇提取率的影響；固定液固比40∶1m L/g、超聲時(shí)間30m in的條件，考察超聲功率分別為10、30、50、70、90、110、130W時(shí)對(duì)蘭坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影響；固定液固比40∶1m L/g、超聲功率30W的條件，考察超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60、70m in時(shí)對(duì)蘭坪被毛孢中多糖及D-甘露醇提取率的影響；固定液固比40∶1m L/g、超聲時(shí)間30min、超聲功率30W的條件，考察浸泡時(shí)間分別為0、2、4、6、8、10h時(shí)對(duì)蘭坪被毛孢中多糖及D-甘露醇提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定浸泡時(shí)間為8h，選擇對(duì)多糖和D-甘露醇提取率響應(yīng)值有顯著影響的因素及水平，使用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，分別以液固比、超聲時(shí)間和超聲功率為三個(gè)獨(dú)立變量A、B、C，以-1、0、1代表各變量水平，對(duì)自變量進(jìn)行編碼（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Levels and codes of variable chose forBox-Behnken design

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Design Expert 8.0.6軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液固比對(duì)多糖和D-甘露醇提取率的影響 由圖1可知，多糖和D-甘露醇的提取率隨液固比升高而升高，都在35∶1m L/g之后趨于平穩(wěn)，原因可能是隨著液固比的增加，多糖和D-甘露醇的溶解量增加，使兩種成分的提取率升高。

圖1 液固比對(duì)蘭坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

2.1.2 超聲功率對(duì)多糖和D-甘露醇提取率的影響由圖2可知，多糖和D-甘露醇的提取率隨超聲功率的提高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均在超聲功率為50W時(shí)提取率較高，原因可能是超聲功率的過(guò)度提高會(huì)產(chǎn)生一定的空化效應(yīng)或化學(xué)效應(yīng)，導(dǎo)致兩成分的破壞，從而降低提取率。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)多糖和D-甘露醇提取率的影響由圖3可知，多糖的提取率隨超聲時(shí)間的升高而升高，在50m in后趨于平穩(wěn)，而D-甘露醇在超聲時(shí)間為40m in后趨于平穩(wěn)，原因可能是多糖成分含量較高，在延長(zhǎng)超聲時(shí)間時(shí)能更充分的提取到溶劑中，而D-甘露醇含量較低，40m in左右的超聲時(shí)間就可以提取較完全。

圖2 超聲功率對(duì)蘭坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

圖3 超聲時(shí)間對(duì)蘭坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

2.1.4 浸泡時(shí)間對(duì)多糖和D-甘露醇提取率的影響由圖4可知，多糖和D-甘露醇的提取率隨浸泡時(shí)間升高而升高，在8h之后趨于平穩(wěn)，原因可能是隨著浸泡時(shí)間的增加，細(xì)胞的吸脹作用增大，使細(xì)胞易破裂，從而導(dǎo)致提取率升高。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)蘭坪被毛孢中多糖和D-甘露醇提取率的影響Fig.4 Effect of soak period on the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol in Hirsutella lanpingensis

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)方案，多糖和D-甘露醇提取率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。使用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，得到多糖和D-甘露醇的二次多元回歸方程分別為：

多糖=21.9+2.32A+1.68B+0.32C-0.84AB-0.52AC+ 1.05BC-0.66A2-2.75B2-2.98C2

D-甘露醇=2.18+0.28A+0.098B+0.15C+0.096AB+ 0.22AC+0.12BC-0.29A2-0.099B2-0.33C2

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及多糖和D-甘露醇提取率的測(cè)定值Table 2 Box-Behnken design and the responses of the extraction rate of total polysaccharide and D-mannitol

表3 回歸模型的方差分析Table 3 ANOVA analysis for response surface quadraticmodel

對(duì)多糖和D-甘露醇的二次多元回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。表3顯示兩個(gè)模型p值分別為0.0003和0.0035，均小于0.05可說(shuō)明兩模型顯著，且兩模型失擬項(xiàng)p值分別為0.9031和0.1005均大于0.05為不顯著，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.9656和0.9251，說(shuō)明兩個(gè)模型擬合程度較好，模型的調(diào)整確定系數(shù)R2Adj分別為0.9213和0.8287，說(shuō)明模型1可解釋92.13%的響應(yīng)值變化，模型2能解釋82.87%的響應(yīng)值變化，利用模型1、2對(duì)優(yōu)化超聲綜合提取多糖和D-甘露醇工藝進(jìn)行一定的分析及預(yù)測(cè)具有一定的可靠性。

模型1回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如下：一次項(xiàng)A、B、二次項(xiàng)B2、C2的p值均小于0.01達(dá)到極顯著水平，表明液固比、超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率有顯著影響；二次項(xiàng)BC的p值小于0.05，表明超聲時(shí)間與超聲功率的交互作用對(duì)多糖提取率的影響為顯著。

模型2回歸方程的系數(shù)顯著性檢驗(yàn)如下：一次項(xiàng)A、二次項(xiàng)A2的p值均小于0.01達(dá)到極顯著水平，表明液固比對(duì)D-甘露醇的提取率有顯著影響；一次項(xiàng)C、二次項(xiàng)C2的p值均小于0.05，表明超聲功率對(duì)D-甘露醇影響顯著；二次項(xiàng)AC的p值小于0.05表明液固比與超聲功率的交互作用對(duì)甘露醇提取率的影響顯著。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，多糖提取率的響應(yīng)面見(jiàn)圖5～圖7；D-甘露醇的響應(yīng)面見(jiàn)圖8～圖10。

圖5中多糖提取率隨液固比和超聲時(shí)間的增大而增大最后趨于平穩(wěn)，且多糖提取率隨液固比的變化大于隨超聲時(shí)間的變化，說(shuō)明液固比對(duì)提取率的影響大于超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響；多糖提取率隨液固比的升高而升高，當(dāng)液固比達(dá)到40∶1m L/g左右后，提取率隨液固比的升高變化不大。

圖5 液固比和超聲時(shí)間影響多糖提取率的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

圖6中多糖提取率隨超聲功率的提高先升高后下降，呈拋物線(xiàn)趨勢(shì)，隨液固比的升高而升高，超聲功率和液固比的交互作用，響應(yīng)值隨液固比的變化大于隨超聲功率的變化，說(shuō)明液固比對(duì)提取率的影響大于超聲超聲功率對(duì)提取率的影響。

圖6 液固比和超聲功率影響多糖提取率的響應(yīng)面Fig.6 Response surface of liquid-solid ratio and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

圖7中超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)多糖提取率的影響均成拋物線(xiàn)形，即隨超聲時(shí)間和功率的增大，提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)；超聲時(shí)間和超聲功率的交互作用對(duì)多糖提取的影響顯著，表現(xiàn)為曲面較陡。

圖7 超聲時(shí)間和超聲功率影響多糖提取率的響應(yīng)面Fig.7 Response surface of ultrasonic time and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

圖8中D-甘露醇提取率隨液固比升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，但隨超聲時(shí)間變化而變化較緩慢，可以說(shuō)明液固比相對(duì)于超聲時(shí)間對(duì)D-甘露醇提取率的影響更為顯著。

圖8 液固比和超聲時(shí)間影響D-甘露醇提取率的響應(yīng)面Fig.8 Response surface of liquid-solid ratio and ultrasonic time on the extraction rate of D-mannitol

圖9中D-甘露醇提取率分別隨液固比和超聲功率的增加呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)之后逐漸平緩，且兩因素的交互曲面較陡，說(shuō)明兩因素的交互作用顯著。

圖10可知，超聲功率對(duì)D-甘露醇提取率影響變化相對(duì)較大，超聲功率和超聲時(shí)間的交互作用較為不明顯，表現(xiàn)為曲面較緩。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析，得到的較優(yōu)提取工藝條件為：液固比43∶1m L/g，超聲時(shí)間50m in，超聲功率56W。在該工藝條件下蟲(chóng)草多糖提取率的理論值為23.11%，D-甘露醇提取率的理論值為2.36%。

Optimization of ultrasonic extraction of polysaccharides and D-mannitol from Hirsutella lanpingensis by response surface methodology

DU Ya-xi1，YU Hong2，GE Feng1，*，LIU Di-qiu1，CHEN Chao-yin1
（1.Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Yunnan Herbal Laboratory，Institute of Herb Biotic Resources，Yunnan University，Kunming 650091，China）

The ultrasonic extraction technology of polysaccharides and D-mannitol was optimized by responsesurface methodology at room temperature. The polysaccharides and D-mannitol were extracted by water fromthe solid fermentation culture of Ophiocordyceps lanpingensis anamorph（Hirsutella lanpingensis）. On the basisof single factor ultrasonic extraction in water at room temperature，the effects of ultrasonic time，ratio of liquid tomaterial and ultrasonic power were investigated to extract polysaccharides and D-mannitol，and the technologywas optimized by response surface methodology. The results showed that the optimum technology was asfollows:the liquid-solid ratio 43∶1mL/g，extraction time 50min，and extraction power 56W. Under the conditions，the extraction rates of polysaccharides and D-mannitol were 23.06％ and 2.30％，respectively.

Ophiocordyceps lanpingensis；Hirsutella lanpingensis；response surface methodology；ultrasonic extraction

TS201.1

B

1002-0306（2015）08-0294-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.08.053

2014－08－14

杜亞茜（1989-），女，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用真菌學(xué)。

*通訊作者：葛鋒（1979-），男，博士，教授，研究方向：植物代謝工程，生物制藥。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260070）。