籍芳，孫玉慧，李天寶，*，王春利，劉煒，李文斌

（1.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門529000；2.北京迪馬科技有限公司，北京100000）

奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的測定

籍芳1，孫玉慧1，李天寶1，*，王春利1，劉煒1，李文斌2

（1.江門出入境檢驗檢疫局，廣東江門529000；2.北京迪馬科技有限公司，北京100000）

建立了同時測定奶粉香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的超高效液相色譜法。樣品用水溶解后使用ProElut PXA固相萃取柱進行樣品前處理凈化，C18柱分離，超高效液相色譜儀進行色譜分析。結(jié)果表明，香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素在0.5 mg/L～20 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；方法的檢出限（S/N=3）分別為0.20、0.25、0.25 mg/L；添加水平在2.5 mg/L～10.0 mg/L時加標回收率為80.3%～102.7%，相對標準偏差為1.85%～4.11%（n=6）。該方法結(jié)果準確可靠，可實現(xiàn)奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的快速同步分析。

固相萃??；超高效液相色譜；奶粉；香蘭素；甲基香蘭素；乙基香蘭素

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素均是重要的食用香料，用途十分廣泛，通常在食品、日化、煙草工業(yè)中作為香原料、矯味劑或定香劑，其中飲料、糖果、糕點、餅干、面包和炒貨等食品用量居多，另外還可做飼料的添加劑、電鍍行業(yè)的增亮劑、制藥行業(yè)的中間體。研究表明，大劑量食用可導(dǎo)致頭痛、惡心、嘔吐、呼吸困難，甚至損傷肝、腎。根據(jù)GB 2760-2011《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》要求，凡使用范圍涵蓋0至6個月嬰幼兒配方食品，不得添加任何食用香料。

目前，文獻報道測定香蘭素的方法有紫外分光光度法［1-2］、高效液相色譜法［3-8］、電化學(xué)法［9］、熒光分光光度法［10］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［11-13］。但鮮見固相萃取結(jié)合超高效液相色譜法測定奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的研究報道。本文通過優(yōu)化樣品的凈化和分離條件，建立了同時測定奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的超高效液相色譜方法，以期為保證奶粉質(zhì)量和人體健康提供技術(shù)支持。

1　實驗部分

1.1儀器與試劑

Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；3-30K型冷凍離心機：德國Sigma公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi公司。

香蘭素標準品（純度≥99.0%，CAS No.121-33-5）：環(huán)境保護部環(huán)境標準研究所；甲基香蘭素標準品（純度≥99.0%，CAS No.120-14-9）：環(huán)境保護部環(huán)境標準研究所；乙基香蘭素標準品（純度≥99.0%，CASNo.121-32-4）：環(huán)境保護部環(huán)境標準研究所；甲醇，乙酸，乙腈（色譜純）：美國Tedia公司；SPE固相萃取柱（ProElut PXA 150 mg/6 mL）：北京迪馬科技有限公司；有機系微孔濾膜（孔徑0.45 μm）：天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

標準儲備溶液配制：準確稱取香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素標準品，分別用乙腈配制成1.0 mg/mL的單標儲備液；

混合標準溶液配制：吸取一定體積的單標儲備液用50%乙腈水溶液配制成0.1 mg/mL的混合中間液。

1.2奶粉樣品

本文選用4種國產(chǎn)品牌和4種進口品牌共8個品牌的嬰幼兒奶粉，均購自本地大型超市，留作加標試驗和實際樣品測定試驗。

1.3樣品前處理

取1.0 g奶粉于25 mL離心管中，加入20 mL水混勻，振搖5 min，8 000 r/min下離心2 min；取出10 mL上清液，待凈化。

依次向固相萃取柱中加入6 mL甲醇和6 mL水，流出液棄去，固相萃取柱活化完畢。將待凈化液加入經(jīng)活化的固相萃取柱中，流出液棄去；再用6 mL 20%甲醇水淋洗，流出液棄去；向柱中加入6 mL 5%乙酸甲醇溶液，收集流出液；將流出液在45℃下減壓蒸至完全干燥，用50%乙腈水定容至1 mL后上UPLC分析。

1.4色譜條件

色譜柱：EndeavorsilC18柱，1.8μm，100mm×2.1mm；流動相：乙腈+0.02 mol/L醋酸銨溶液=8+92（體積比，用醋酸調(diào)pH=3.5）；流速：0.3 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：2 μL；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：280 nm。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品凈化條件的優(yōu)化

由于奶粉基質(zhì)比較復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量較高，需要在前處理過程對目標物進行凈化、富集。因此，本方法采用經(jīng)過活化的固相萃取柱ProElut PXA對奶粉樣品溶液進行進化處理，達到對目標物質(zhì)香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素凈化、富集的目的，處理后的溶液直接使用超高效液相色譜儀進行測定。實驗證明，該法操作簡單，凈化效果好，加標回收率大于80%，可以滿足各種奶粉中的香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素日常檢測要求。

2.2液相色譜條件的選擇

2.2.1檢測波長的選擇

香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的特征吸收峰主要為229、278、308、279和309 nm，本文選擇280 nm作為檢測波長，結(jié)果目標物質(zhì)分離效果好、峰形對稱。

2.2.2流動相選擇

分別以乙腈+0.02 mol/L醋酸銨溶液=8+92，乙腈+ 0.02 mol/L醋酸銨溶液=20+80，乙腈+0.02 mol/L醋酸銨溶液=35+65，乙腈+0.02 mol/L醋酸銨溶液=5+95作為流動相進行實驗，結(jié)果當流動相為乙腈+0.02 mol/L醋酸銨溶液=8+92，并用醋酸調(diào)pH=3.5時，香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的保留時間分別為7.1、16.8、18.1 min，分離效果好，峰形對稱。

2.3線性范圍與檢出限

用流動相稀釋制備濃度為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的系列濃度標準溶液，按優(yōu)化色譜條件進行測定。結(jié)果表明，在香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的濃度為0.5 mg/L～20.0 mg/L時，色譜峰面積（A）與其質(zhì)量濃度（ρ）間呈良好線性關(guān)系，線性方程分別為A= 7 331.5ρ+253.4（r2=0.999 7）、A=6 034.6ρ+35.56（r2= 0.999 7）和A=5 373.7ρ-716.25（r2=0.999 8）。以S/N=3確定本方法的檢出限，得到香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的檢出限分別為0.20、0.25、0.25 mg/L。

2.4回收率與精密度

采用加標回收法，以不含香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的奶粉為空白樣品基質(zhì)，在2.5 mg/kg和10.0 mg/kg的回收率及相對標準偏差（RSD）見表1。

從表1中可以看出，香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的回收率分別為80.3%～102.7%、82.9%～100.5%和80.6%～90.6%，RSD分別為2.22%～3.43%、3.90%～4.11%和1.85%～2.81%。圖1、圖2和圖3分別為標準溶液、加標樣品溶液以及空白樣品溶液的液相色譜圖。

表1　香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素加標回收率與相對標準偏差Table 1Recoveries and RSDs for vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin

圖1　香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素混標色譜圖Fig.1Chromaograms of mixed standard solution

圖2　香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素加標色譜圖Fig.2Chromaograms of spiked blank sample

圖3　香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素空白色譜圖Fig.3Chromaograms of blank sample

2.5實際樣品的分析

隨機抽取本地超市銷售的4個國內(nèi)品牌和4個進口品牌共8種嬰幼兒配方奶粉，按照本文建立的方法進行檢測，均未檢出香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素。

3　結(jié)論

由于奶粉基質(zhì)比較復(fù)雜，所以需要在前處理過程對目標物凈化、富集。本文所建立的奶粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素檢測方法，使用ProElut PXA進行樣品前處理凈化，有效去除蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，凈化效果優(yōu)異；超高效液相色譜柱Endeavorsil C18進行色譜分析，可實現(xiàn)香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的快速完全分離，結(jié)果準確可靠。

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Determination of Vanillin，Methyl Vanillin and Ethyl Vanillin in Milk Powder

JI Fang1，SUN Yu-hui1，LI Tian-bao1，*，WANG Chun-li1，LIU Wei1，LI Wen-bin2
（1.Jiangmen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Jiangmen 529000，Guangdong，China；2.Dikma Technologies Incorporation，Beijing 100000，China）

An ultra performance liquid chromatography（UPLC）method was developed for the simultaneous determination of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in milk powder.Samples were dissolved with water，purified with solid phase extraction column，separated with C18column，and determined with ultra performance liquid chromatography.The results showed that there were good linear relationships between peak areas and concentrations of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in the range of 0.5 mg/L-20 mg/L，with limits of detection of 0.20 mg/L，0.25 mg/L and 0.25 mg/L，respectively.The recoveries at spiked levels of 2.5 mg/L-10.0 mg/L were in the range of 80.3%-102.7%，with the relative standard deviations（RSDs，n=6）of 1.85%-4.11%.The method was sensitive and reliable，and could achieve the fast simultaneous analysis of vanillin，methyl vanillin and ethyl vanillin in milk powder.

solid phase extraction；Ultra performance liquid chromatography；milk powder；vanillin；methyl vanillin；ethyl vanillin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.13.022

2014-05-08

廣東省科技計劃項目（2011B010400019）；國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2014IK169）

籍芳（1979—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要研究方向：進出口商品檢驗。

李天寶（1981—），男（漢），高級工程師，碩士研究生，主要研究方向：進出口商品檢驗。