李 慧，王朝江，楊紅敏，高春燕

（河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北　石家莊　050051）

河北省常栽平菇種質(zhì)資源評(píng)價(jià)

李 慧，王朝江，楊紅敏，高春燕*

（河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北石家莊050051）

為了解河北省栽培平菇種質(zhì)資源情況，同時(shí)發(fā)掘優(yōu)異種質(zhì)資源，更好的為平菇育種工作提供基礎(chǔ)材料，本研究收集了河北省常栽的平菇品種共83株，通過(guò)拮抗試驗(yàn)對(duì)其“同物異名”菌株進(jìn)行初步鑒定；基于ITS序列分析進(jìn)行分類鑒定.并進(jìn)一步對(duì)體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和菌株的天然基質(zhì)生長(zhǎng)速率、抗霉力等部分生物學(xué)特性進(jìn)行了測(cè)定分析.結(jié)果表明：河北省平菇栽培品種“同物異名”現(xiàn)象較為嚴(yán)重，經(jīng)拮抗試驗(yàn)將83個(gè)平菇菌株劃分為31個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)親和群；經(jīng)ITS序列比對(duì)分析，31個(gè)體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和菌株中包括15株糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus）、9株佛州側(cè)耳（P.floridanus）、2株白黃側(cè)耳（P.cornucopiae）、1株肺形側(cè)耳（P.pulmonarius）及4株未界定種；經(jīng)生物學(xué)特性分析篩選出了2株棉籽殼基質(zhì)生長(zhǎng)最適宜菌株和2株棉柴屑基質(zhì)生長(zhǎng)最適宜菌株，以及7個(gè)抗霉能力較強(qiáng)菌株，為后續(xù)的定向育種工作提供了優(yōu)良材料.

平菇；種質(zhì)資源；ITS；棉柴；抗霉力

平菇是我國(guó)栽培最為廣泛的食用菌之一，也是河北省最主要的食用菌栽培品種［1］.實(shí)際生產(chǎn)中，糙皮側(cè)耳、白黃側(cè)耳、佛羅里達(dá)側(cè)耳、肺形側(cè)耳均統(tǒng)稱為平菇［2］.近幾年，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，傳統(tǒng)品種出現(xiàn)菌種退化等現(xiàn)象［3］，栽培者對(duì)平菇新品種的需求越來(lái)越大，于是不同區(qū)域相互引種、老種新名導(dǎo)致了栽培品種菌種混雜、種源不清、同物異名嚴(yán)重、假冒偽劣菌種充斥市場(chǎng)，這嚴(yán)重制約了食用菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展.此外，隨著傳統(tǒng)栽培原料棉籽殼成本增加，新型栽培基質(zhì)的研發(fā)顯得尤有重要［4］.本研究，廣泛收集河北省實(shí)際生產(chǎn)中栽培用的平菇品種，結(jié)合拮抗試驗(yàn)及ITS序列分析對(duì)平菇種質(zhì)資源進(jìn)行初步鑒別及物種分類，并考察了傳統(tǒng)栽培基質(zhì)（棉籽殼）和新型栽培基質(zhì)（棉柴）上的菌絲生長(zhǎng)速率及菌絲抗霉力兩個(gè)重要育種材料篩選指標(biāo)［5-6］，旨在解決河北省栽培平菇菌種名混亂現(xiàn)象，為實(shí)際生產(chǎn)的菌種流通提供數(shù)據(jù)參考，并為下一步的平菇育種工作提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持.

1　材料和方法

1.1供試菌株

本研究以河北省常栽平菇品種的83個(gè)菌株為材料，來(lái)源于科研單位或菌種公司，其中1～24號(hào)菌株來(lái)自于河北省農(nóng)林科學(xué)院，25～36號(hào)菌株來(lái)自于河北工程大學(xué)，37～47來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，48～71來(lái)自于石家莊市食用菌創(chuàng)新研究所（菌種公司），72～83來(lái)自于唐山市農(nóng)科院.供試菌株編號(hào)及菌種名見(jiàn)表1.

表1　供試菌株Tab.1 The tested strains

1.2拮抗試驗(yàn)

1.2.1拮抗方法 首先將供試菌株接種于PDA培養(yǎng)基上活化，參考李何靜［7］的方法，將活化菌種塊接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃倒置暗光培養(yǎng)，觀察并記錄兩個(gè)接種塊菌落交界處的拮抗反應(yīng).

1.2.2體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和菌株的篩選 根據(jù)Korolev N［8］及鄭素月［3］研究表明，同一營(yíng)養(yǎng)親和群內(nèi)的菌株為同一菌株或來(lái)源相同且遺傳關(guān)系很近的菌株.基于本研究為篩選育種材料的目的，宜選擇親緣關(guān)系差異大的材料，故本研究對(duì)于同一營(yíng)養(yǎng)親和群內(nèi)菌株，隨機(jī)選擇一個(gè)菌株用于后續(xù)研究.

1.3體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和菌株ITS序列分析

參考黃晨陽(yáng)［9］的方法對(duì)體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和性菌株進(jìn)行ITS-PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，對(duì)于未測(cè)序成功的，采用克隆后再測(cè)序.利用DNASTAR Lasergene 7.1中的SeqMan軟件去除序列末端測(cè)序質(zhì)量差或載體序列，并進(jìn)一步拼接得到完整序列，利用NCBI中的Blast軟件包對(duì)DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，確認(rèn)分子生物學(xué)物種.

1.4天然基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定

天然基質(zhì)選取傳統(tǒng)栽培基質(zhì)—棉籽殼及近幾年河北省逐漸推廣使用的新型基質(zhì)—棉柴屑［5］為材料，以體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和性菌株為研究對(duì)象.用打孔器取活化菌株菌落邊緣生長(zhǎng)旺盛的同齡菌種塊，接種到裝有滅菌天然基料的大試管中，置于25℃下暗光培養(yǎng).每個(gè)測(cè)試菌株設(shè)3個(gè)重復(fù)，觀察并測(cè)量天然基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速率.并采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析.

1.5抗霉力測(cè)定

采用PDA平板對(duì)峙培養(yǎng)法.將活化的平菇菌絲打孔取相同大小的菌絲塊接種到PDA平板的一邊，25℃培養(yǎng)3 d后，再將同樣大小的平菇木霉菌絲塊接種到另一邊共同培養(yǎng)，一段時(shí)間后，觀察平菇菌絲與霉菌菌絲拮抗情況.如果平菇菌絲與木霉菌絲對(duì)峙生長(zhǎng)，有明顯拮抗線，則視為抗霉能力強(qiáng).反之，如果平菇菌絲不能與木霉菌絲對(duì)峙生長(zhǎng)，被木霉菌絲生長(zhǎng)覆蓋，則視為抗霉力弱.

圖1　部分菌株的拮抗測(cè)定結(jié)果Fig.1 The results of antagonistic test for oyster mushroom strains

2　結(jié)果與分析

2.1體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)親和性測(cè)定結(jié)果

該試驗(yàn)測(cè)定了83個(gè)菌株兩兩之間的拮抗反應(yīng)，部分菌株的拮抗反應(yīng)見(jiàn)圖1.根據(jù)菌絲交界處是否產(chǎn)生拮抗現(xiàn)象，將無(wú)拮抗反應(yīng)的菌株劃為同一營(yíng)養(yǎng)親和群，視為營(yíng)養(yǎng)親和菌株；有拮抗反應(yīng)的菌株劃為不同營(yíng)養(yǎng)親和群，視為營(yíng)養(yǎng)非親和菌株.83個(gè)供試菌株共劃分為31個(gè)不同營(yíng)養(yǎng)親和群（表2）.其中有16個(gè)營(yíng)養(yǎng)親和群包含2個(gè)及以上菌株，推測(cè)這些菌株可能是“同物異名”.其中組6包含的菌株數(shù)最多為14個(gè)，次之為組10包含8株，組13包含7株.這三組中的雙抗黑平、冀農(nóng)11及原生2號(hào)均為河北省栽培最為廣泛的平菇品種.從31個(gè)營(yíng)養(yǎng)親和群中隨機(jī)選取一株組成營(yíng)養(yǎng)非親和性菌株群進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

表2　拮抗試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The result of antagonism

2.2體細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)非親和性菌株ITS序列分析結(jié)果

該試驗(yàn)的31個(gè)營(yíng)養(yǎng)非親和性菌株采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序未成功的有2個(gè)，經(jīng)克隆后測(cè)序成功.利用NCBI中的Blast軟件包對(duì)31個(gè)菌株的ITS拼接序列（含ITS1，5.8S rDNA和ITS2）與Genbank登陸的已知物種的ITS序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，各菌株的序列相似性指數(shù)從96%到100%不等.依據(jù)Hughes&Petersen［10］認(rèn)為傘菌的ITS序列差異不超過(guò)2%～3%可定為同種的原則，31個(gè)菌株中有15株P(guān).ostreatus（菌株編號(hào)為4、5、9、12、20、23、26、28、37、40、46、47、62、66、68）、9株P(guān).floridanus（菌株編號(hào)為1、2、14、17、24、45、76、78、83）、2株P(guān).cornucopiae（菌株編號(hào)為38和39）、1株P(guān).pulmonarius（菌株編號(hào)68）.有4個(gè)菌株（菌株編號(hào)為7、13、34、66）的序列與Genbank登陸的P.ostreatus或P.floridanus比對(duì)相似性指數(shù)在97%以下，不能準(zhǔn)確界定物種.但這也可能跟ITS-PCR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)堿基錯(cuò)配有關(guān).

2.3天然基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速率測(cè)定

分別測(cè)定了31個(gè)營(yíng)養(yǎng)非親和性菌株在棉籽殼和棉柴屑上的菌絲生長(zhǎng)速率，結(jié)果顯示（表4和5），不同菌株分別在棉籽殼和棉柴屑兩種不同天然基質(zhì)上的菌絲生長(zhǎng)速度差異較大，總體來(lái)講菌絲在棉柴屑上的生長(zhǎng)速率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于棉籽殼，但同一菌株在兩種基質(zhì)上的生長(zhǎng)速率差別較大，棉籽殼上生長(zhǎng)最快的菌株為豫平5號(hào)和558，而棉柴屑上生長(zhǎng)最快的菌株為中蔬10號(hào)及特早新豐.這可能與不同菌株分解不同基質(zhì)相關(guān)酶系的活性不同有關(guān).

表4　平菇菌株在棉籽殼上的菌絲生長(zhǎng)速率比較Tab.4 The mycelial growth rateof oyster mushroom strains on cottonseed hull substrate

表5　平菇菌株在棉柴屑上的菌絲生長(zhǎng)速率比較Tab.5 The mycelial growth rate of oyster mushroom strains oncotton stalk substrate

2.4抗霉力測(cè)定結(jié)果

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法評(píng)價(jià)了31個(gè)供試菌株的抗霉能力，如圖2所示，A菌株表現(xiàn)為平菇菌絲與木霉菌絲對(duì)峙生長(zhǎng)，兩者形成比較明顯的拮抗線，而B(niǎo)菌株表現(xiàn)為木霉菌絲可以覆蓋平菇菌絲生長(zhǎng)，不能形成拮抗線，認(rèn)為A菌株的抗霉能力比B菌株強(qiáng).結(jié)果顯示，有7個(gè)平菇菌株抗霉能力較強(qiáng)，分別為雙抗黑平、秦風(fēng)黑平、2028、中蔬10號(hào)、灰美2號(hào)、CCEF99及CCEF89.有5個(gè)菌株抗霉能力較差，分別為高平88、小白平、2016、基因2005及夏抗50.

圖2　部分菌株的抗霉力測(cè)定結(jié)果Fig.1 The results ofresistance to Trichoderma of oyster mushroom strains

3　討論

平菇是河北省栽培最為廣泛的食用菌品種之一，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，傳統(tǒng)品種老化退化，勞動(dòng)力成本以及栽培原料價(jià)格不斷上漲等因素都制約了平菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，種菇者亟需高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病抗雜能力強(qiáng)、栽培基質(zhì)適應(yīng)范圍廣的優(yōu)良新品種.但是，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下的平菇菌種市場(chǎng)“同物異名”現(xiàn)象仍較為嚴(yán)重，1個(gè)雙抗黑平菌株竟有14個(gè)名字，實(shí)際生產(chǎn)中錯(cuò)種、假種的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生，本研究以現(xiàn)有河北省廣泛栽培的平菇菌種為材料，初步解決了平菇品種混亂的現(xiàn)象，可以為平菇生產(chǎn)提供種源清楚的菌株.

自從Gardes et al將ITS應(yīng)用到真菌鑒定以來(lái)，以ITS序列分析為基礎(chǔ)的真菌鑒定被廣泛應(yīng)用［11-12］.但黃晨陽(yáng)等［9］研究認(rèn)為ITS序列存在近緣種種內(nèi)差異比種間大的問(wèn)題，以及數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息的不準(zhǔn)確性等因素造成了該方法的不準(zhǔn)確.另外，金健康等［13］研究證明P.ostreatus、P.cornucopiae和P.floridanus為同一可交配群體，所以從生物學(xué)種的概念出發(fā)，P.ostreatus、P.cornucopiae和P.floridanus可以認(rèn)為是同一個(gè)糙皮側(cè)耳生物種群［14-15］.故本研究的31個(gè)河北省常栽平菇菌株除菌株基因2005為P.pulmonarius，其他菌株可認(rèn)為是同一糙皮側(cè)耳生物種群.

棉籽殼是食用菌代料栽培的主要原料，近幾年，棉籽殼的價(jià)格逐漸上漲，然而由于棉籽脫絨技術(shù)的提高，棉籽殼營(yíng)養(yǎng)含量卻在下降，從而導(dǎo)致了食用菌生產(chǎn)成本升高、生物轉(zhuǎn)化率降低的現(xiàn)象.科研人員因此研究了多種農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品作為食用菌新型栽培基質(zhì)并取得了成功［16-17］.棉柴同樣作為棉花副產(chǎn)品，其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于棉籽殼，近幾年已成功被用于部分食用菌的生產(chǎn)中［5，18-20］.本研究初步評(píng)價(jià)了河北省常栽平菇菌株對(duì)棉柴基質(zhì)的利用能力，為棉柴栽培平菇適宜菌株的篩選提供了數(shù)據(jù)支持.同時(shí)，認(rèn)為對(duì)于食用菌新型基質(zhì)的研發(fā)，除了對(duì)高產(chǎn)配方的研究外，還需要考慮對(duì)基質(zhì)適應(yīng)性強(qiáng)的菌株的選育.

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責(zé)任編輯：高 山

Evaluation on Germplasm of Oyster Mushroom Cultivated in Hebei Province

LI Hui，WANG Chaojiang，YANG Hongmin，GAO Chunyan*
（Institute of Genetics and Physiology of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Shijiazhuang 050051，China）

In order to evaluate the germplasm of oyster mushroom cultivated in Hebei province and find high-quality strains to be used as breeding samples，eighty-three oyster mushroom strains were collected. Antagonistic test of the 83 strains were employed to identify the same strain with different names.Internal Transcribe Spacer（ITS）of the tested strains were sequenced to identify the molecular species.Mycelial growth rate on two natural substrates and antibacterial action to Trichoderma of the vegetative incompatible strains was determined.The results showed that the 83 tested strains were divided into 31 vegetative compatibility groups including 15 strains of Pleurotus ostreatus，9 strains of P.floridanus，2 strains of P.cornucopiae，one strain of P.pulmonarius and 4 strains of uncertain species.Two strains were screened that were most suitable for growing on cottonseed hull and two strains on cotton stalk.Seven strains were showed excellent resistance to Trichoderma.These strains can be used as excellent samples for future breeding study.

Oyster mushroom；germplasm；ITS；cotton stalk；resistance to Trichoderma

S646.1+5

A

1008-8423（2015）04-0425-05DOI：10.13501/j.cnki.42-1569/n.2015.12.018

2015-10-12.

河北省農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（A2015110103）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-24）.

李慧（1986-），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事食用菌栽培與育種的研究；*

高春燕（1964-），女，副研究員，主要從事食用菌育種與栽培方面的研究.