蔡孝莉 冉麗丹 文國容 金 海 庹必光遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,貴州遵義563000
泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMCC-7721遷移、侵襲及凋亡的影響
蔡孝莉冉麗丹文國容金海庹必光
遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,貴州遵義563000
目的觀察泮托拉唑?qū)θ烁伟┘?xì)胞SMMC-7721遷移、侵襲及凋亡的影響,預(yù)測其對人肝癌的抗癌作用。方法體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞,細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)分為對照組和泮托拉唑不同濃度組(20、40、80、120、160μmol/L),對其進(jìn)行干預(yù),用細(xì)胞小室(Transwell)觀察其對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響;用Transwell小室上鋪設(shè)基質(zhì)膠觀察泮托拉唑?qū)?xì)胞侵襲的影響;細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為對照組和泮托拉唑不同濃度組(40、80、160、320、640μmol/L),用流式細(xì)胞儀檢測其對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果泮托拉唑20μmol/L組對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的遷移和侵襲與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而泮托拉唑40、80μmol/L組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),并且泮托拉唑120、160μmol/L組與對照組比較差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);另外,泮托拉唑40μmol/L組對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而泮托拉唑80、160、320、640μmol/L組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論泮托拉唑能抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721遷移和侵襲,并促進(jìn)凋亡,可能對人肝癌具有一定的抗癌作用。
泮托拉唑;肝癌細(xì)胞;細(xì)胞運(yùn)動(dòng)
肝癌是我國最高發(fā)的惡性腫瘤之一,因其高侵襲、高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),多數(shù)患者在確診以后的生存時(shí)間較短。目前除了手術(shù)、化療等,尚無很好的治療方法,且療效不如人意。研究發(fā)現(xiàn)[1-3],質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)對實(shí)體瘤細(xì)胞具有抗腫瘤活性,但對正常細(xì)胞則無影響。但目前國內(nèi)外關(guān)于PPIs對惡性腫瘤的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的泮托拉唑作用于肝癌細(xì)胞SMMC-7721,觀察其對肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲及凋亡能力的影響,為肝癌的治療提供新的思路和方向。
1.1實(shí)驗(yàn)材料
人肝癌細(xì)胞SMCC-7721購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞所;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清及胰蛋白酶均購于美國Hyclone公司;泮托拉唑購于美國Sigma公司;Matriger基質(zhì)膠購于美國BD公司;Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物公司;二氧化碳培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司;圖像分析系統(tǒng)購于德國Lecia公司;流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。
1.2分組與給藥
細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)分為對照組(細(xì)胞懸液不加任何藥物)、泮托拉唑不同濃度組(20、40、80、120、160μmol/L);細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分為對照組和泮托拉唑不同濃度組(40、80、160、320、640μmol/L);將用無血清培養(yǎng)基配制好的相應(yīng)濃度的泮托拉唑加入事先準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液中。
1.3實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期細(xì)胞,用無血清培養(yǎng)饑餓24 h后,加入胰酶消化,用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基終止胰酶消化,并制成細(xì)胞懸液,使細(xì)胞懸液的終濃度為2×104/mL以備用;取孔徑為8μm的Transwell小室,上室分別加入以上配置好的終濃度為2×104/mL細(xì)胞懸液100μL,其中,在對照組中上室再加入含無血清的培養(yǎng)基100μL,實(shí)驗(yàn)組則分別再加入事先用無血清培養(yǎng)基配制的各濃度的泮托拉唑100μL,使上室細(xì)胞懸液血清濃度為5%,下室則加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基500μL;于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,取出細(xì)胞小室,用棉簽擦掉上室中的液體,用PBS緩沖液淋洗2遍,晾干;4%多聚甲醛固定15min后,用蒸餾水沖洗2遍,每次2min;然后蘇木精復(fù)染7min后,再用自來水沖洗10min;95%乙醇5 s,晾干;伊紅染色2min;75%酒精清洗2遍,每次2min;95%酒精清洗2遍,每次2min;二甲苯透明5 min后,用鑷子將Transwell的膜取下,置于載玻片上,中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察細(xì)胞從上室遷移到下室膜表面的細(xì)胞個(gè)數(shù)并拍照,隨機(jī)選取10個(gè)低倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),并計(jì)算平均值。
1.3.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)事先將基質(zhì)膠取出,置于4℃過夜備用;在Transwell小室上室鋪設(shè)基質(zhì)膠,基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1∶3稀釋,37℃孵育30 min,待其凝固后用無血清培養(yǎng)基水化備用;上室加入細(xì)胞懸液100μL,其濃度為1×105/mL;其中,對照組再加入無血清培養(yǎng)基100μL,其余各組加入用無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度的泮托拉唑100μL;于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,取出細(xì)胞小室,用棉簽輕輕擦掉上室中的基質(zhì)膠;用PBS清洗2遍,晾干;其余操作步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。
1.3.3細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞SMCC-7721,接種在35mm×12mm的培養(yǎng)皿中,細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為1×105/mL,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待其貼壁。細(xì)胞貼壁后,棄培養(yǎng)基,PBS緩沖液洗滌2次,加入含泮托拉唑的新培養(yǎng)基,泮托拉唑終濃度分別為40、80、160、320、640μmol/L,每濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,對照組用不含藥物的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基代替。培養(yǎng)24 h后,收集上清液中細(xì)胞及貼壁細(xì)胞,用PBS洗滌2次,用1×Binding Buffer懸浮細(xì)胞,調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL,取300μL放入5 mL離心管中,各管分別先加5μL Annexin V-FITC,混勻,再加5μL PI混勻。避光反應(yīng)15min后用流式細(xì)胞儀檢測凋亡。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響
與對照組比較,泮托拉唑20μmol/L組對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的遷移沒有影響(P>0.05),泮托拉唑40、80、120、160μmol/L組能抑制細(xì)胞的遷移,并隨著藥物濃度的提高,抑遷移作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。見圖1、表1。
2.2泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞侵襲的影響
與對照組比較,泮托拉唑20μmol/L組對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的侵襲沒有影響(P>0.05),泮托拉唑40、80、120、160μmol/L組能抑制細(xì)胞的侵襲作用,且隨著藥物濃度的提高,抑制侵襲作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。見圖2、表2。
圖1 不同濃度泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響(HE染色,200×)
表1 泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響(個(gè),±s,n=8)
表1 泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞遷移的影響(個(gè),±s,n=8)
注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
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圖2 不同濃度泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞侵襲的影響(HE染色,200×)
表2 泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞侵襲的影響(個(gè)s,n=8)
表2 泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞侵襲的影響(個(gè)s,n=8)
注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
?
2.3泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響
與對照組比較,泮托拉唑40μmol/L組對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡沒有影響(P>0.05),泮托拉唑80、160、320、640μmol/L組能促進(jìn)細(xì)胞的凋亡,且隨著藥物濃度的提高,促凋亡作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05或P<0.01)。見圖3、表3。
圖3 不同濃度泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響
表3 不同濃度泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響(%,±s,n=8)
表3 不同濃度泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響(%,±s,n=8)
注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01
組別凋亡率對照組泮托拉唑40μmol/L組泮托拉唑80μmol/L組泮托拉唑160μmol/L組泮托拉唑320μmol/L組泮托拉唑640μmol/L組2.10±0.80 2.10±1.06 5.03±0.51*28.20±2.26*34.20±8.45**70.70±12.02**
隨著腫瘤逐漸成為人類健康的主要威脅,尋找既能殺傷腫瘤細(xì)胞,又對人體正常細(xì)胞不良反應(yīng)小或無不良反應(yīng)的化療藥物成為近年來腫瘤治療方面的新方向。V-ATPases是一種多蛋白復(fù)合物,廣泛分布于真核細(xì)胞的囊泡膜和細(xì)胞膜,依賴ATP逆濃度梯度將H+泵出細(xì)胞外或者泵入細(xì)胞器囊泡腔內(nèi),維持細(xì)胞器的pH在7.0左右[4-5]。在大多數(shù)實(shí)體腫瘤細(xì)胞中,V-ATPases表達(dá)過量,并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤呈正相關(guān),從而造就了腫瘤酸性微環(huán)境。有學(xué)者認(rèn)為,腫瘤酸性微環(huán)境是癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[6-8]。Chen等[6]發(fā)現(xiàn)PPI能抑制V-ATPases的表達(dá),并扭轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)膜pH的梯度。研究發(fā)現(xiàn)人肝癌細(xì)胞中的V-ATPases明顯上調(diào),抑制V-ATPases可延緩肝癌細(xì)胞的生長[9]。因此,阻斷V-ATPases的表達(dá)可以抑制人類癌癥的生長和轉(zhuǎn)移。最近研究腫瘤酸化的機(jī)制為針對VATPases提供了新的策略[10]。PPIs這類藥物符合這一目標(biāo)[11]。
PPIs是一類臨床治療酸相關(guān)疾病安全有效的藥物。泮托拉唑是一種PPIs,能在pH<4的酸性環(huán)境下發(fā)揮抑制酸的作用,臨床常用來抑制胃酸和應(yīng)用于酸相關(guān)的疾病,其具有良好的安全性,幾乎沒有副作用。本實(shí)驗(yàn)選用不同濃度的PPIs泮托拉唑干預(yù)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721,觀察其對人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的遷移、侵襲及凋亡的情況,從PPIs對癌癥的影響這一角度著手探討,本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),選用不同濃度的泮托拉唑作用于SMMC-7721人肝癌細(xì)胞24 h后,與對照組比較,泮托拉唑20μmol/L組對細(xì)胞的遷移和侵襲無明顯影響(P>0.05),在40μmol/L時(shí)有明顯的抑制作用(P<0.05),并且隨著藥物濃度的增加作用逐漸增強(qiáng)。另外,選用不同濃度的泮托拉唑作用于SMMC-7721人肝癌細(xì)胞24 h后,與對照組比較,40μmol/L泮托拉唑?qū)?xì)胞的凋亡無明顯影響(P>0.05),在80μmol/L時(shí)有明顯的促凋亡作用(P<0.05),并且隨著藥物濃度的增加作用逐漸增強(qiáng)。
我國是全球肝癌發(fā)病率最高和病死數(shù)最多的國家,肝癌患者占全球的55%,腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者生存期的重要因素,肝癌的高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率是直接導(dǎo)致肝癌患者死亡的主要原因[12]。尋找影響肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移,及促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的藥物已成為臨床亟待解決的問題。PPIs一直以抑制胃酸分泌而著稱,被廣泛運(yùn)用于消化道潰瘍及反流性食管炎等酸相關(guān)性疾病。但新近的研究發(fā)現(xiàn),PPIs可抑制腫瘤局部酸的分泌,從而抑制多種腫瘤的侵襲遷移等,如胃腺癌[13]、胰腺癌[14]、甲狀腺癌[15]、黑色素瘤[16]等,可是,目前泮托拉唑?qū)Ω伟┑淖饔萌圆磺宄?。本?shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示,泮托拉唑能抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞的侵襲和遷移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,泮托拉唑可能成為臨床治療肝癌的安全而有效的藥物,但本實(shí)驗(yàn)僅從細(xì)胞水平探索泮托拉唑?qū)Ω伟┘?xì)胞SMMC-7721的影響,而具體通過怎樣的機(jī)制發(fā)揮作用還有待進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。
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Effects of Pantoprazole on m igration,invasion and apoptosis of human liver carcinoma SMCC-7721 cells
CAIXiaoli RAN Lidan WEN Guorong JIN Hai TUO Biguang
Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Guizhou Province,Zunyi 563000,China
Ob jective To investigate the effects of Pantoprazole on themigration,invasion and apoptosis of human liver carcinoma SMMC-7721 cell,and to predict its anti-cancer effect on liver cancer.Methods In vitro cultivation of human liver carcinoma SMMC-7721 cells,cellmigration and invasion experiments were divided into control group and different concentrations of Pantoprazole groups(20,40,80,120,160μmol/L),Transwell chamber assay was used to detect the migration of SMMC-7721 cells.Transwell chamber assay was used to detect the invasion of SMMC-7721 cells.Cell apoptosis experimentwas divided into control group and different concentrations of Pantoprazole groups(40,80,160,320,640μmol/L),F(xiàn)CM test was used to detect the apoptosis of SMMC-7721 cells.Results The migration and invasion of Pantoprazole 20μmol/L group had no statistically significant differences in SMMC-7721 cells compared with control group(P>0.05),while Pantoprazole 40,80μmol/L group had a statistically significant difference compared with control group(P<0.05),and Pantoprazole 120,160μmol/L group were highly statistically significant different compared with control group(P<0.01).In addition,apoptosis of Pantoprazole 40μmol/L group was not statistically significant in SMMC-7721 cells compared with control group(P>0.05),and Pantoprazole 80,160,320,640μmol/L group were statistically significant compared with control group(P<0.05 or P<0.01).Conclusion Pantoprazole can inhibit human liver carcinoma SMCC-7721 cellsmigration and invasion,and promote apoptosis,it may have certain anti-cancer effect on human liver.
Pantoprazole;Hepatoma cell;Cellmovement
R735.7
A
1673-7210(2015)05(a)-0007-05
2015-01-06本文編輯:張瑜杰)
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360311)。
蔡孝莉(1987.1-),女,遵義醫(yī)學(xué)院2012級消化內(nèi)科專業(yè)在讀碩士研究生,主要從事消化系統(tǒng)腫瘤及離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)研究。
庹必光(1963.8-),男,博士,教授,主要從事消化系統(tǒng)腫瘤及離子通道轉(zhuǎn)運(yùn)研究。