白楊素對實驗性糖尿病大鼠心臟損害的保護(hù)作用及其機制

糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死亡原因［1］。越來越多的研究顯示，高血糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的過量自由基造成的氧化應(yīng)激在糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［2-3］。糖尿病心肌病是糖尿病性心臟病的特異性病變，其發(fā)病機制尚未完全明了。白楊素，化學(xué)名稱為5，7-二羥基黃酮，是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一種具有廣泛藥理活性的黃酮類化合物，其在蜂膠中的量較高，是蜂膠的主要有效成分之一。研究證明，它具有抗感染、抗氧化、防治心腦血管疾病等多種藥理作用［4-5］。本實驗腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立大鼠糖尿?。―M）模型，探討白楊素的降血糖和心臟保護(hù)作用及其機制。

1　材料與方法

1.1動物

健康清潔級SD雄性大鼠50只，體重160～180 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（動物合格證號：DK0503-0031）。

1.2試劑藥品與儀器

STZ（Sigma，美國），白楊素（純度大于98%）（大連美侖生物），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德），強生穩(wěn)豪倍易型血糖儀及強生穩(wěn)豪倍易型血糖試紙，酶標(biāo)儀（生工生物有限公司）。

1.3糖尿病模型建立與分組

1.3.1制備糖尿病動物模型SD大鼠普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度20～25℃，通風(fēng)良好，分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，禁食12 h后測空腹血糖，隨機選取10只大鼠作為正常組，其余40只大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg（用0.1 mol/L pH=4.2檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制），正常組腹腔注射等劑量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。于給藥3 d后斷尾取血測空腹血糖，選取空腹血糖≥16.7mmol/L為糖尿病大鼠模型［4］。

1.3.2分組與灌胃31只成模SD大鼠，隨機分為模型組、白楊素低劑量組、白楊素高劑量組，模型組11只，低、高劑量組各組10只。成模1周后，低、高劑量組分別給予白楊素50、100mg/（kg·d），連續(xù)灌胃21 d。白楊素用0.1%羧甲基纖維素鈉配制成混懸液，正常組和模型組則給予等容量的0.1%羧甲基纖維素鈉。實驗期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.4檢測指標(biāo)

1.4.1血糖和體重測定斷尾取血，每周定點測量各組大鼠空腹血糖（FBG）和體重。

1.4.2丙二醛含量及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶活性測定給藥結(jié)束時各組大鼠均禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心，取上清；迅速剖離心臟組織，剪取lmm3大小的心肌組織于10%中性甲醛溶液中固定切片，其余液氮速凍，-76℃冰箱保存，制備10%組織勻漿，離心，取上清。按照SOD、MDA、GSH-Px測試盒說明書檢測血清和心臟組織的MDA含量及SOD、GSH-Px活性。

1.4.3心臟組織HE染色將用10%中性甲醛固定的心臟組織切成4μm厚的切片，切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1　白楊素對實驗性糖尿病大鼠體重的影響（g，±s）

表1　白楊素對實驗性糖尿病大鼠體重的影響（g，±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與白楊素低劑量組比較，ΔP＜0.05；動物只數(shù)不包含剔除

組別只數(shù)造模前給藥前給藥后7 d 14 d 21 d正常組模型組白楊素低劑量組白楊素高劑量組10 991 0 190.6±11.7 190.4±15.2 191.9±10.1 191.6±11.7 200.7±15.2 183.0±11.6**184.9±8.4 185.1±9.6 214.4±15.9 169.0±11.3**168.6±6.3 178.9±10.6 224.0±18.5 157.9±8.5**159.4±6.5 174.8±10.6#Δ231.0±19.1 150.1±10.3**156.3±11.5 167.9±9.2#

表2　白楊素對實驗性糖尿病大鼠空腹血糖的影響（mmol/L，±s）

表2　白楊素對實驗性糖尿病大鼠空腹血糖的影響（mmol/L，±s）

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01，與白楊素低劑量組比較，ΔΔP＜0.01；動物只數(shù)不包含剔除

組別只數(shù)造模前給藥前給藥后7 d 14 d 21 d正常組模型組白楊素低劑量組白楊素高劑量組10 991 0 5.1±0.3 5.3±0.7 5.4±0.4 5.2±0.5 5.3±0.6 30.2±3.1**30.8±2.3 30.9±2.5 5.2±0.8 32.4±2.3**29.4±2.0##28.8±1.9##5.3±0.4 31.2±2.3**26.2±1.9##25.8±1.8##5.3±0.6 31.4±1.7**25.5±1.6##21.5±2.1##ΔΔ

2　結(jié)果

2.1白楊素對實驗性糖尿病大鼠體重、空腹血糖的影響

一般情況：正常組大鼠皮毛光澤，反應(yīng)敏捷，體重隨著飼養(yǎng)逐漸增加；模型組大鼠毛發(fā)直立、光澤晦暗，反應(yīng)遲鈍，體重下降，可見明顯多尿、多飲、多食癥狀；與模型組相比，白楊素低劑量組、白楊素高劑量組同樣出現(xiàn)“三多”現(xiàn)象，但程度較輕，體重下降較為緩慢。

與正常組相比，模型組大鼠體重顯著下降、FBG水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，白楊素高劑量組大鼠體重明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)BG水平明顯降低（P＜0.01）；與白楊素低劑量組相比，白楊素高劑量組大鼠體重升高（P＜0.05），F(xiàn)BG水平下降（P＜0.01）。見表1、2。

2.2大鼠心臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

與正常組相比，模型組大鼠SOD、GSH-Px活性明顯下降（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，白楊素低、高劑量組SOD、GSH-Px活性明顯升高（P＜0.01），MDA含量下降（P＜0.05）；與白楊素低劑量組相比，白楊素高劑量組SOD、GSH-Px活性升高更明顯（P＜0.01），MDA含量下降（P＜0.05）。見表3。

表3　白楊素對實驗性糖尿病大鼠心臟組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響（±s）

表3　白楊素對實驗性糖尿病大鼠心臟組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白楊素低劑量組比較，ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；動物只數(shù)不包含剔除

組別只數(shù)MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH-Px（U/mg）正常組模型組白楊素低劑量組白楊素高劑量組10 991 0 0.4±0.1 0.9±0.6*0.7±0.3#0.6±0.2#Δ86.7±3.9 49.8±14.7**62.0±10.8##74.6±10.9##ΔΔ230.8±22.6 134.5±10.0**156.6±8.5##185.9±4.3##ΔΔ

2.3大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

與正常組相比，模型組大鼠SOD、GSH-Px活性明顯下降（P＜0.01），MDA含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，白楊素低、高劑量組SOD、GSH-Px活性明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），MDA含量下降（P＜0.05）；與白楊素低劑量組相比，白楊素高劑量組SOD、GSH-Px活性升高更明顯（P＜0.05），MDA含量下降（P＜0.05）。見表4。

表4　白楊素對實驗性糖尿病大鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響（±s）

表4　白楊素對實驗性糖尿病大鼠血清MDA含量及SOD、GSH-Px活性的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與白楊素低劑量組比較，ΔP＜0.05；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽過氧化物酶；動物只數(shù)不包含剔除

組別只數(shù)MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH-PX（U/mg）正常組模型組低劑量組高劑量組10 777 0.8±0.1 2.8±0.1*2.6±0.1#2.3±0.2#Δ137.0±10.7 75.7±9.9**98.6±20.5#114.0±21.1##Δ1705.8±86.9 832.1±208.5**1246.6±89.8##1448.6±76.0##Δ

2.4白楊素對實驗性糖尿病大鼠心臟組織形態(tài)的影響

心臟組織HE染色可見，正常組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞之間連接緊密，排列有序；模型組心肌細(xì)胞疏松、水腫，排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤；白楊素低劑量組心肌細(xì)胞間隙增寬，排列較紊亂；白楊素高劑量組心肌細(xì)胞，組織間隙疏松不明顯，排列較緊密，紋理較清晰。見圖1。

3　討論

黃酮類化合物是一類高藥理活性的天然化合物，可以通過清除自由基，減輕脂質(zhì)過氧化，調(diào)節(jié)糖脂代謝，提高機體胰島素敏感性，改善胰島素抵抗等途徑降低血糖，起到防治糖尿病及其并發(fā)癥的作用［4］。白楊素在植物界中分布廣泛，是人類發(fā)現(xiàn)的第一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗感染、防治心腦血管疾病、抗腫瘤等多種藥理作用［5-6］。

圖1　白楊素對實驗性糖尿病大鼠心肌形態(tài)學(xué)的影響（HE，400×）

糖尿病心肌病是糖尿病最常見的心血管并發(fā)癥之一，是獨立于冠狀動脈病變、微血管病變和自主神經(jīng)病變之外的心肌結(jié)構(gòu)改變和功能失調(diào)［7］。在病理上主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大、局灶性壞死、細(xì)胞外基質(zhì)堆積、間質(zhì)纖維化［8］。利用STZ一次性腹腔注射誘發(fā)大鼠糖尿病是目前國內(nèi)外使用較多的也較為可靠的一種糖尿病動物模型制備方法［9］。本實驗成功建模后動物空腹血糖值≥16.7 mmol/L，出現(xiàn)體重下降和多飲、多尿、多食癥狀。心臟組織形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞疏松、水腫，細(xì)胞間隙增寬，排列紊亂，有炎癥細(xì)胞浸潤，未見典型的心肌細(xì)胞肥大、局灶性壞死?？赡芘c早期糖尿病模型觀察時間短（4周）有關(guān)。盡管未見典型性糖尿病心肌病結(jié)構(gòu)表現(xiàn)，但已經(jīng)提示糖尿病早期即可引發(fā)一定程度的心臟損害。研究顯示，及時給予白楊素可降低糖尿病大鼠空腹血糖，改善“三多一少”癥狀，一定程度上避免心肌損傷。

糖尿病時，高糖環(huán)境促使ROS生成增加，ROS可通過多元醇途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）途徑和氨基己糖途徑等引發(fā)糖尿病并發(fā)癥。另外，高血糖還可以導(dǎo)致抗氧化酶的糖基化，使機體抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，清除自由基的能力降低［10-11］，這些因素均可引起心肌組織的嚴(yán)重?fù)p傷。研究發(fā)現(xiàn)，ROS參與了糖尿病心肌病的發(fā)病，在血液中和心肌中均發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激物的存在［12］。自由基造成對機體組織損傷的程度主要與脂質(zhì)過氧化物MDA含量及抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px等）活性變化有關(guān)［13-14］。本研究糖尿病大鼠血清和心肌組織檢測顯示，MDA含量增加及抗氧化酶（SOD、GSH-Px）活性降低，白楊素可增加糖尿病大鼠血液及心臟組織的GSH-Px、SOD活性，降低MDA水平。表明白楊素對糖尿病大鼠心臟保護(hù)作用可能與其抗氧化作用有關(guān)。另外有研究表明，白楊素有一定的醛糖還原酶抑制作用［15］。多元醇代謝活性亢進(jìn)為糖尿病并發(fā)癥的成因之一，糖尿病發(fā)生時醛糖還原酶作為多元醇通路的限速酶被激活，導(dǎo)致細(xì)胞代謝與功能的損害，參與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展［11］。白楊素的醛糖還原酶抑制作用是否參與糖尿病心肌病的保護(hù)有待進(jìn)一步研究。

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李倩陳敏李潔欣李潔張軒萍
山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研組，山西太原030001

目的觀察白楊素對實驗性糖尿病大鼠心臟損害的保護(hù)作用，探討其保護(hù)機制。方法一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液建立大鼠實驗性糖尿病模型。成模大鼠隨機分為模型組、白楊素低劑量組［灌胃，50mg/（kg·d）］和白楊素高劑量組［灌胃，100mg/（kg·d）］。每周定點測量各組體重和空腹血糖，3周后禁食12 h麻醉大鼠，取血和心臟組織，測定其丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性。HE染色觀察心臟組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果與模型組相比，白楊素低、高劑量組大鼠血糖顯著降低，血清和心臟組織SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量下降（P＜0.05），心臟損傷程度明顯減輕。結(jié)論白楊素對實驗性糖尿病大鼠的心臟損害有一定保護(hù)作用，可能與其抗氧化作用相關(guān)。

白楊素；糖尿??；氧化應(yīng)激；心臟損害

Thecardiaprotection andmechanism of chrysin for exprimentaldiabetic rats

LIQian CHEN Min LIJiexin LIJie ZHANG Xuanping
Department of Pharmacology，ShanxiMedical University，Shanxi Province，Taiyuan 030001，China

Objective To investigate the cardiaprotection of chrysin for exprimental diabetic rats and its related mechanism.M ethods Streptozotocin（STZ）was given to induce the diabetic ratsmodel.Themodel rats were divided into themodel group，chrysin low dose group［ig，50 mg/（kg·d）］and chrysin high dose group［ig，100 mg/（kg·d）］.Rats weight and fasting blood glucose（FBG）were detected weekly.After 3 weeks，rats were given anesthesia after 12 h ambrosia，blood and cardiac tissue were obtained.The concentration of malondialdehyde（MDA），the activity of superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in serum and myocardium were measured.The morphology changes of heart tissue was observed with HE staining.Results Compared with the model group，in the chrysin low dose group and the chrysin high dose group，the FBG level decreased，the activities of SOD and GSH-Px increased，MDA contentdecreased，with statistically significant differences（P＜0.05）.Conclusion Chrysin treatment has a protective effect on myocardial injury in diabetic rats，whichmay be related to antioxidant effect．

Chrysin；Diabetesmellitus；Oxidative stress；Heart damage

R285.5

A

1673-7210（2015）05（a）-0015-04

2014-12-04本文編輯：程銘）

山西省自然科學(xué)基金（2011011034-3）；山西醫(yī)科大學(xué)青年基金資助項目（Q02201206）。

李倩（1989-），女，山西長治人，山西醫(yī)科大學(xué)2012級藥理學(xué)專業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：心血管藥理學(xué)。

李潔（1972-），女，山西太原人，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：心血管藥理學(xué)。張軒萍（1969-），女，山西運城人，博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：心血管藥理學(xué)。