曾超

重慶市公安消防總隊醫(yī)院普外科，重慶400060

浸潤性乳腺癌中14-3-3σ蛋白的表達與ER、PR的相關性研究

曾超

重慶市公安消防總隊醫(yī)院普外科，重慶400060

目的探討浸潤性乳腺癌組織中14-3-3σ蛋白的表達與雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）的相關性。方法選擇2012年12月～2014年10月重慶市公安消防總隊醫(yī)院手術切除的浸潤性乳腺癌組織標本55例及其相應的癌旁正常組織31例為研究對象，分別將其作為浸潤性乳腺癌組織組和正常乳腺組織組。采用免疫組化SP法檢測乳腺組織中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表達情況；采用Pearson相關系數分析14-3-3σ蛋白表達水平與ER、PR的相關性。結果浸潤性乳腺癌組織14-3-3σ蛋白及ER陽性表達率明顯低于正常乳腺組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；浸潤性乳腺癌組織PR陽性表達率與正常乳腺組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；浸潤性乳腺癌組織中，14-3-3σ蛋白陽性表達率明顯低于ER、PR，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；正常乳腺組織中，14-3-3σ蛋白、ER及PR表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同年齡、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移情況的浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、組織分型、分化程度、PR及ER表達情況的浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。Pearson相關性分析顯示，14-3-3σ蛋白與ER陽性表達呈正相關（r=0.3334，P＜0.05），14-3-3σ蛋白與PR無相關性（P＞0.05）。結論14-3-3σ蛋白可能參與浸潤性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移，14-3-3σ與ER的聯合檢測可成為乳腺癌患者預后判斷的重要指標。

浸潤性乳腺癌；14-3-3σ；雌激素受體；孕激素受體；相關性

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重影響女性身心健康，甚至危及生命［1］，因此，早期診斷、治療及其預后一直是人們研究的焦點。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞凋亡受阻、細胞周期失控等因素密切相關。特異性上皮細胞因子14-3-3σ被認為是一種新的腫瘤抑制基因，在細胞周期調控、細胞凋亡、DNA損傷、信號轉導、細胞分化、細胞增殖中發(fā)揮重要作用。研究表明，14-3-3σ蛋白的失表達發(fā)生于人類多種腫瘤［2-6］。乳腺癌細胞中雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progesterone receptor，PR）水平的測定在乳腺癌的臨床治療和預后判斷上的重要作用已被廣泛接受并應用。本研究選擇重慶市公安消防總隊醫(yī)院（以下簡稱“我院”）55例浸潤性乳腺癌患者為研究對象，檢測其14-3-3σ蛋白、ER、PR表達情況，并分析14-3-3σ蛋白表達與ER、PR的相關性，探討14-3-3σ在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機制。

1　資料與方法

1.1一般資料

選擇2012年12月～2014年10月我院手術切除的浸潤性乳腺癌組織標本55例作為研究對象，所有患者均經乳腺癌手術切除及組織病理學證實。所有患者均為女性，年齡28～70歲，平均（49.1±10.4）歲。根據WHO組織學分型及分級標準，其中浸潤性導管癌35例，浸潤性小葉癌20例；高分化癌13例，中分化癌29例，低分化癌13例；腋窩淋巴結轉移40例，無腋窩淋巴結轉移15例。根據國際抗癌聯盟（IUCC）2003年乳腺癌TNM分期，其中Ⅰ期16例，Ⅱ期30例，Ⅲ期7例，Ⅳ期2例。另取同一患者的癌旁＞5 cm處乳腺組織，且經病理證實為正常乳腺組織31例。所有患者術前均未進行放、化療及內分泌治療。所有患者均知情同意并簽署知情同意書，且研究經我院醫(yī)學倫理會批準通過。

1.2主要試劑及儀器

鼠抗人14-3-3σ多克隆抗體、兔抗人14-3-3σ多克隆抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），免疫組化SP試劑盒（DAKOenvi-sionDenMar），DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術有限公司），0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液，Harris蘇木精，二甲苯，磷酸氫二鈉（Na2HPO4），磷酸二氫鈉（NaH2PO4）。CRM440切片機（日本Sakura公司），顯微鏡（日本Olympus公司），照相系統(tǒng)（日本Olympus公司），載玻片、蓋玻片（鹽城耀華玻璃儀器廠）。

1.3方法

采用免疫組化SP法檢測乳腺組織中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表達情況，組織塊10%中性甲醛固定后，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度約4 μm，每例選取5張，一張用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）代替一抗，作為陰性對照，其余分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色及免疫組化染色。石蠟切片65℃烤片15 min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5 min，95%乙醇Ⅰ、Ⅱ脫二甲苯各1 min，0.01 mol/L PBS振洗5 min× 3次，倒盡PBS；放入3%H2O2中，37℃孵育20 min以滅活內源性過氧化物，PBS振洗5 min×3次，倒盡PBS；熱修復抗原，滴加適量正常牛血清封閉液PBS振洗2遍后加封閉液，完全蓋住組織片部分，37℃孵育30 min，擦干多余液體，加1∶100的一抗（兔抗人14-3-3σ多克隆抗體），PBS代替一抗作為陰性對照。37℃孵育30 min，4℃冰箱過夜；滴加二抗SP（辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG多聚體）37℃孵育15 min，PBS振洗5 min×3次，倒盡PBS；DAB顯色5～15 min，H2O2溶液沖洗終止反應，蘇木精輕度復染細胞核＜1 min，PBS沖洗返藍；脫水，封片，閱片，拍照，高倍鏡下觀察結果。

1.4結果判斷標準

ER和PR蛋白定位于細胞核，均呈棕黃色顆粒狀。以400倍的高倍鏡觀察5個視野，每個視野觀察計數100個細胞，計數3次。鏡下觀察：對細胞膜及細胞核出現棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞進行分析，根據整張切片中陽性細胞占全部細胞的比例定為：（-）陽性細胞數＜10%，且細胞無顯色或背景深，染色不清；（+）陽性細胞數≥10%細胞顯色。

14-3-3σ蛋白的表達以乳腺導管和小葉上皮細胞漿有棕黃色著色為陽性胞漿。隨機選取10個高倍鏡視野（200倍），計數1000個細胞，以積分法計算結果，即根據每張切片的染色強度和陽性細胞比例計分。著色強度：無色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。著色細胞比例：無著色0分；＜30%為1分；30%～60%為2分；＞60%為3分。兩者相加0～2分為陰性；3～4分為陽性；5～6分為強陽性。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗；Pearson系數檢測相關性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1浸潤性乳腺癌組織與正常乳腺組織14-3-3σ、ER及PR表達情況的比較

浸潤性乳腺癌組織14-3-3σ蛋白及ER陽性表達率明顯低于正常乳腺組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；浸潤性乳腺癌組織PR陽性表達率與正常乳腺組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；浸潤性乳腺癌組織中，14-3-3σ蛋白陽性表達率明顯低于ER、PR，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；正常乳腺組織中，14-3-3σ蛋白、ER及PR陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1　浸潤性乳腺癌組織與正常乳腺組織14-3-3σ、ER及PR表達情況的比較［n（%）］

2.2浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征與14-3-3σ蛋白表達的關系

不同年齡、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移情況的浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、組織分型、分化程度、ER及PR表達情況的浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2　浸潤性乳腺癌患者臨床病理特征與14-3-3σ蛋白表達的關系［n（%）］

2.3浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白表達與PR、ER的相關性分析

55例浸潤性乳腺癌患者中，ER陽性的32例患者中，14-3-3σ蛋白陽性表達者13例，而23例患者中ER陰性表達的僅2例，Pearson相關性分析發(fā)現，14-3-3σ蛋白與ER陽性表達呈正相關（r=0.3334，P＜0.05），14-3-3σ蛋白與PR無相關性（P＞0.05）。見表3。

表3　浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白表達與PR、ER的相關性分析（例）

3　討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，且患者日漸趨于年輕化。據統(tǒng)計，全球年約有100萬例新發(fā)乳腺癌患者，每年死亡人數＞41萬例［7］。早期診斷是提高臨床治愈率和降低病死率的關鍵所在。在采用傳統(tǒng)診斷方法判斷腫塊是否癌變前，致癌基因通常已經發(fā)生改變，因此，腫瘤相關基因以及特異性標志物一直是腫瘤早期診斷的研究熱點。腫瘤的發(fā)生本質上是原癌基因激活和抑癌基因失活，目前對抑癌基因的研究成為腫瘤研究的熱點。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素及多階段步驟的復雜過程，基因水平研究也一直是乳腺癌研究的熱點。1965年，Moore等［8］在動物的腦組織中發(fā)現抑癌基因14-3-3σ（也叫HME1），該基因定位于1q35，是負責G2周期檢控點的基因家族成員，在細胞周期信號傳導途徑中起重要作用，負責細胞損傷的修復，它所編碼的蛋白幾乎在所有真核生物細胞中都有表達，高表達于正常乳腺上皮。然而，研究發(fā)現，該基因在人類乳腺癌中經常失活，且在原發(fā)性膀胱癌、腸癌、骨巨細胞瘤、食管鱗癌、宮頸癌、肝癌、鼻咽癌中的表達也明顯下調或失表達［2-6，9］，是人類乳腺癌中經常失活的重要抑癌基因。Boudreau等［10］研究顯示，隨著腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，14-3-3σ蛋白表達逐漸下降，表明其在乳腺癌中是一種腫瘤抑制蛋白，可能成為乳腺癌發(fā)生、發(fā)展事件的監(jiān)測指標。

乳腺癌是激素依賴性惡性腫瘤，其腫瘤細胞的生長、增殖受體內性激素水平的影響。ER、PR的檢測對判斷乳腺癌的發(fā)展、預后、指導內分泌治療具有一定的意義，近來研究認為，當乳腺組織癌變時，ER和PR會部分消失或者全部消失［11-14］。研究表明，乳腺癌ER和PR表達陰性者，遠處轉移率高，骨轉移和腦轉移發(fā)生率也很高，預后差［15］，提示檢測ER和PR表達情況對于判斷預后很有意義。

目前，國內尚未見關于乳腺癌組織中14-3-3σ蛋白表達與ER、PR的相關性研究，但Wang等［16］研究發(fā)現，14-3-3σ在人類子宮平滑肌瘤的下調表明其在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，其機制可能與上調ER和PR表達有關。本研究選擇我院手術切除的浸潤性乳腺癌組織標本55例作為研究對象，同時選取同一患者的癌旁＞5 cm處乳腺組織，且經病理證實為正常乳腺組織31例，采用免疫組化SP法檢測各乳腺組織中14-3-3σ蛋白及ER、PR的表達情況，研究發(fā)現，浸潤性乳腺癌組織14-3-3σ蛋白、ER陽性表達率均明顯低于正常乳腺組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），而浸潤性乳腺癌組織PR陽性表達率與正常乳腺組織比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；浸潤性乳腺癌組織中，14-3-3σ蛋白陽性表達率明顯低于ER、PR，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），這與劉廷等［17］的研究一致。正常乳腺組織中，14-3-3σ蛋白、ER及PR表達情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示14-3-3σ蛋白低表達可能在乳腺惡性轉化中起著重要作用，且進一步研究發(fā)現，不同年齡、腫瘤大小、腋窩淋巴結轉移情況浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白陽性表達率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；不同TNM分期、組織分型、分化程度、PR及ER表達情況的浸潤性乳腺癌患者14-3-3σ蛋白陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），提示14-3-3σ蛋白低表達可能與ER、PR的低表達存在某種相關性，Pearson相關性分析發(fā)現，14-3-3σ蛋白與ER陽性表達呈正相關（r=0.3334，P＜0.05），14-3-3σ蛋白與PR無相關性（P＞0.05），提示14-3-3σ蛋白與ER陽性表達呈較弱的相關性。

綜上所述，14-3-3σ蛋白可能參與浸潤性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移，同時檢測14-3-3σ蛋白可以評估浸潤性乳腺癌的發(fā)生及預后。14-3-3σ與ER的聯合檢測可成為乳腺癌患者預后判斷的重要指標。

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Correlation study of 14-3-3σ and ER，PR expression in invasive breast cancer tissue

ZENG Chao
Department of General Surgery，Public Security Fire Corps Hospital in Chongqing City，Chongqing400060，China

Objective To explore the relationship between the expression of 14-3-3σ and ER，PR in invasive breast cancer tissue.Methods 55 cases of breast cancer tissues with surgical resection from December 2012 to October 2014 in Public Security Fire Corps Hospital of Chongqing City and 31 cases of normal tissue adjacent to carcinoma were selected as invasive breast cancer tissue group and normal breast tissue group respectively.The expression of 14-3-3σ protein，ER and PR in breast tissues were detected by immunohistochemical（SP method），and the relationship between the expression of 14-3-3σ and ER，PR were analyzed by Pearson correlation coefficient.Results The positive expression rate of 14-3-3σ protein and ER in invasive breast cancer tissue was significantly lower than that of normal breast tissue respectively，with statistical difference（P＜0.05 or P＜0.01）.The positive expression rate of PR in invasive breast cancer tissue was compared with normal breast tissue，with no statistical difference（P＞0.05）.The positive expression rate of 14-3-3σ protein in invasive breast cancer patients with different age，tumor size，axillary lymph node metastasis was compared respectively，with no statistical difference（P＞0.05）.The positive expression rate of 14-3-3σ protein in invasive breast cancer patients with different TNM stage，histological type，differentiation degree，PR and ER was compared respectively，with statistical difference（P＜0.05）.Pearson correlation analysis showed that 14-3-3σ protein was positively related with ER（r=0.3334，P＜0.05），but there was no correlation between 14-3-3σ protein and PR（P＞0.05）.Conclusion The 14-3-3σ may be involved in occurrence，development and metastasis of invasive breast cancer，detection of 14-3-3σ combined with ER can be an important index for prognosis of patients with breast cancer.

Invasive breast cancer；14-3-3σ；Estrogen receptor；Progesterone receptor；Correlation

R737.9

A

1673-7210（2015）05（b）-0090-04

2015-02-15本文編輯：李亞聰）