馮家豪　楊偉金　孫　政

廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

T W S119對(duì)結(jié)腸癌LO V O細(xì)胞系增殖能力和耐藥性的影響

馮家豪楊偉金孫政

廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科，廣東廣州510180

目的探討TWS119對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞系的耐藥性和增殖能力的影響。方法將LOVO細(xì)胞系分成3組，分別為2 μmol/L TWS119處理組、1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組，TWS119處理組加入2、1 μmol/L的TWS119，對(duì)照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24 h后分別進(jìn)行Western blot和qRT-PCR檢測(cè)β-鏈蛋白（β-catenin）多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）及P糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，用流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞周期，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞耐藥性變化。結(jié)果與陰性對(duì)照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細(xì)胞中MRP1、P-gp的mRNA和β-catenin、MRP1、P-gp的蛋白表達(dá)，G2/M期細(xì)胞比例均明顯升高（P＜0.05）。雖然1 μmol/L TWS119處理組在5、10 μmol/L5-氟尿嘧啶（5-Fu）作用下存活率無(wú)明顯變化（P＞0.05），但2 μmol/L TWS119處理組存活率明顯升高（P＜0.05）；而且在15 μmol/L 5-FU作用下處理組存活率明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論在體外實(shí)驗(yàn)中，TWS119可以通過(guò)上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性和增殖能力，揭示癌細(xì)胞耐藥性、Wnt/βcatenin通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體如P-gp、MRP1等存在聯(lián)系。

結(jié)直腸癌；化療耐藥；TWS119；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

在各種癌癥中，全球結(jié)直腸癌患病率居第3位，僅次于肺癌和乳腺癌［1］。東亞結(jié)直腸癌發(fā)病率正在上升，可能與生活方式西方化、高脂低纖維飲食、肥胖和吸煙的流行有關(guān)［2］。大部分新發(fā)案例可以接受根治性手術(shù)［3］，但對(duì)于Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，術(shù)后仍需化療［4］；而且20%～30%新發(fā)病例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這些患者即使進(jìn)行根治性手術(shù)，仍有近50%的患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移［5］，對(duì)于這部分患者，系統(tǒng)化療顯得更為重要［4，6］。但單純化療并非根治手段，由于隨著治療的進(jìn)展，癌癥耐藥性會(huì)逐步增強(qiáng)，這與患者藥代動(dòng)力學(xué)、藥物和腫瘤類(lèi)型、耐藥機(jī)制、腫瘤微環(huán)境有關(guān)，機(jī)制非常復(fù)雜［7］。Wnt（wingless integration）信號(hào)通路被證實(shí)與人類(lèi)癌癥有關(guān)［8］，分為Wnt/β-catenin（cadherin-associated protein，β-鏈蛋白，β-1）通路、Wnt/Ca2+通路和WNT/PCP（planar cell polarity）通路［9］。有研究顯示，相關(guān)基因突變導(dǎo)致的Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控失調(diào)出現(xiàn)在大部分結(jié)直腸癌病例中［10］。Wnt/β-catenin可以調(diào)節(jié)c-myc和cyclin D1基因，它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化中起重要作用，在結(jié)腸癌中這些基因常常被異常激活［11］。TWS119是一種人工合成的小分子化合物，它可以促進(jìn)老鼠胚胎腺癌細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，而且發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制為抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）的磷酸化作用，可使胞內(nèi)β-catenin濃度升高進(jìn)而上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性［12］。但TWS119對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用仍未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究TWS119對(duì)LOVO細(xì)胞系的耐藥性和增殖性影響，探討其對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響作用，進(jìn)一步揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路與人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的聯(lián)系。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

LOVO細(xì)胞系（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）分為2 μmol/L TWS119處理組、1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組。在含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），5%CO2、37℃無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，TWS119（Selleck）溶于DMSO中-20℃避光保存，處理組分別加入2、1 μmol/L TWS119［13］，陰性對(duì)照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2qRT-PCR

收集細(xì)胞，用trizol試劑（invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，用兩步法qRT-PCR SYBER試劑盒（TAKARA）檢測(cè)各組細(xì)胞MRP1、P-gp mRNA表達(dá)，各引物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，引物序列（由Invitrogen公司合成）見(jiàn)表1。

表1　各引物序列

1.3Western blot

收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，曝光后掃描，使用Image J軟件分析灰度值。一抗、二抗均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4CCK8

調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接種于96孔板，5-氟尿嘧啶（5-FU）設(shè)5、10、15 μmol/L 3個(gè)濃度梯度，陰性對(duì)照加等體積培養(yǎng)基，各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑（碧云天）作用4 h后酶標(biāo)儀分析吸光度，每組重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞分析

收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌離心后用75%酒精固定過(guò)夜，碘化丙啶試劑（碧云天）染色30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1三組qRT-PCR結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細(xì)胞中P糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP1）mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），且2 μmol/L TWS119處理組較1 μmol/L TWS119處理組P-gp和MRP1 mRNA表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2　三組qRT-PCR結(jié)果

2.2三組Western blot結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細(xì)胞中β-鏈蛋白（βcatenin）、P-gp和MRP1蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），且2 μmol/L TWS119處理組較1 μmol/L TWS119處理組β-cateniu、P-gp和MRP1蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、3。

圖1　三組qRT-PCR結(jié)果

圖2　三組蛋白條帶圖（β-Actin為內(nèi)參）

圖3　三組蛋白條帶灰度值比較

2.3三組細(xì)胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗(yàn)結(jié)果

在5 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細(xì)胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但1 μmol/L TWS119處理組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在10 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細(xì)胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但1 μmol/L TWS119處理組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在15 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細(xì)胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；1 μmol/L TWS119處理組存活率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3、圖4。

表3　三組細(xì)胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗(yàn)存活率（%，±s）

表3　三組細(xì)胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗(yàn)存活率（%，±s）

注：與陰性對(duì)照組比較，▲P＜0.05；與1 μmol/L TWS119處理組比較，*P＜0.05；5-FU：5-氟尿嘧啶

組別5 μmol/L 5-FU 10μmol/L5-FU 15μmol/L5-FU 2 μmol/L TWS119處理組1 μmol/L TWS119處理組陰性對(duì)照組P值93.12±0.76▲*87.20±1.77 80.21±0.79＜0.05 87.40±1.77▲*72.24±5.35 68.43±2.26＜0.05 80.21±0.79▲*68.43±2.26▲59.94±9.08＜0.05

圖4　三組細(xì)胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗(yàn)存活率

2.4TWS119對(duì)增殖細(xì)胞比例的影響

陰性對(duì)照組G2/M期細(xì)胞比例為（6.42±2.62）%、2 μmol/L TWS119處理組G2/M期細(xì)胞比例為（17.8± 1.60）%、1 μmol/L TWS119處理組G2/M期細(xì)胞比例為（11.63±1.59）%。與陰性對(duì)照組比較，2、1 μmol/L TWS119處理組中G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且2 μmol/L TWS119處理組G2/M期細(xì)胞比例明顯高于1 μmol/L TWS119處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3　討論

通常情況下在細(xì)胞內(nèi)由軸抑制蛋白（axis inhibition protein，Axin）、結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1）和GSK-3β組成的復(fù)合體對(duì)β-catenin有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin隨后被泛素-蛋白酶體降解，但Wnt與胞膜上的卷曲蛋白受體（frizzled class receptor）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）結(jié)合后，通過(guò)蓬亂蛋白（dishevelled segment polarity protein，DVL）使上述蛋白復(fù)合體受到抑制，β-catenin在胞內(nèi)得以集聚，濃度升高。β-catenin通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，可以與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子家族（T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor，TCF/ LEF）、環(huán)腺苷酸效應(yīng)元件結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白［cAMP response element-binding protein（CREB）-binding protein，CBP］等結(jié)合，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄反應(yīng)［14-16］。

P-gp和MRP1同屬ATP結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP binding cassette transporter，ABC transporter）家族成員。P-gp由ABCB1基因編碼，在胞膜上有跨膜區(qū)-ATP結(jié)合位點(diǎn)，可以水解ATP釋放能量引起構(gòu)象改變，進(jìn)而使底物排出細(xì)胞［17］。P-gp被證實(shí)與腫瘤耐藥性有關(guān)，使癌細(xì)胞抵抗蒽環(huán)類(lèi)、長(zhǎng)春堿類(lèi)和紫杉醇等化療藥的毒性［18］。MRP1是從P-gp表達(dá)缺失的耐藥細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的，由ABCC1基因編碼，與P-gp類(lèi)似的是，MRP1也有跨膜區(qū)-ATP結(jié)合位點(diǎn)這種功能性結(jié)構(gòu)［19］。在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等疾病中，MRP1過(guò)表達(dá)是化療效果不佳的預(yù)示性指標(biāo)［20］。

本研究結(jié)果表明TWS119可使人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞系β-catenin、P-gp和MRP1表達(dá)上調(diào)，明顯提高細(xì)胞的增殖活性和5-FU耐藥性，且存在劑量依賴(lài)性。該機(jī)制可能是TWS119選擇性抑制GSK-3β磷酸化活性，導(dǎo)致β-catenin在胞內(nèi)濃度上升而使β-catenin/ TCF轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，其下游基因c-myc和cyclin-D1表達(dá)增加均可增強(qiáng)LOVO細(xì)胞增殖活性，而Wnt/βcatenin信號(hào)通路可能與ABCB1和ABCC1兩個(gè)基因表達(dá)有關(guān)，致使P-gp和MRP1表達(dá)增加，對(duì)5-Fu的外排作用增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥性增加。

1 μmol/L TWS119處理組雖然有P-gp和MRP1的表達(dá)上調(diào)，但5、10 μmol/L 5-FU作用下耐藥性較陰性對(duì)照組無(wú)明顯增加，可能是由于胞內(nèi)P-gp和MRP1表達(dá)需提高至一定水平才能顯著影響LOVO細(xì)胞5-FU耐藥性；在15 μmol/L 5FU作用下1 μmol/L TWS119處理組也有顯著耐藥性，可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜?-FU濃度較高時(shí)，P-gp和MRP1的外排泵效率也相應(yīng)提高。

本研究揭示癌細(xì)胞耐藥可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，希望可以為癌細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究提供思路。此外，TWS119在人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞系中能影響信號(hào)通路的活性，可以用于信號(hào)通路的相關(guān)研究。

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Impact of TWS119 on proliferation capacity and chemotherapy resistance of colon cell line LOVO

FENG JiahaoYANG WeijinSUN Zheng
Department of Gastrointestinal Surgery，Guangzhou First People's Hospital，Guangdong Province，Guangzhou510180，China

Objective To discuss the impact of TWS119 on chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell line LOVO.Methods The cell line LOVO was divided into three group，2 μmol/L TWS119 treatment group，1 μmol/L TWS119 treatment group and negative control group，the TWS119 treatment groups were added 2，1 μmol/L TWS119，the negative control group was added equal volume of DMSO，Western blot and qRT-PCR were performed to test the expression of P-gp，β-catenin and MRP1 after 24 h treatment.Flow cytometry and CCK8 test were performed to analyze the cells tolerance change.Results Compared with the negative control group，the mRNA expression of MRP1，P-gp，the protein expression of P-gp，β-catenin and MRP1，the G2/M period cell rate in 2 μmol/L TWS119 treatment group and 1 μmol/L TWS119 treatment group significantly increased（P＜0.05）；the survival rate with 5，10 μmol/L 5-FU treatment had no significantly changed in 1 μmol/L TWS119 treatment group（P＞0.05），while those in 2 μmol/L treatment group significantly increased（P＜0.05），and the survival rate of both treatment group significantly increased with 15 μmol/L 5-FU treatment（P＜0.05）.Conclusion TWS119 can improve the chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell through increasing Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro，these phenomena perhaps reveals there are some relationships among drug resistance of cancer cell，Wnt/β-catenin signaling pathway and the ABC transporter such as MRP1 and P-gp.

Colorectal cancer；Chemotherapy resistance；TWS119；Wnt/β-catenin

R73-36

A

1673-7210（2015）09（a）-0027-05

2015-04-08本文編輯：蘇暢）

馮家豪（1988.9-），男，廣州醫(yī)科大學(xué)2012級(jí)外科學(xué)專(zhuān)業(yè)在讀碩士研究生；研究方向：大腸癌多藥耐藥的分子生物學(xué)機(jī)制及治療。

孫政（1971.3-），男，博士，主任醫(yī)師，廣州市第一人民醫(yī)院胃腸外科副主任，曾獲得2007年廣州市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、2008年廣東省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)；研究方向：胃腸道腫瘤的治療。