趙堂亮吳正敏王萍譚建明

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)帕金森病的臨床療效觀察

趙堂亮1吳正敏2王萍2譚建明2

目的 探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）移植治療帕金森病（PD）的臨床效果及安全性。方法 選擇福州總醫(yī)院干細(xì)胞治療科收治的20例經(jīng)鞘內(nèi)注射UC-MSC治療原發(fā)性PD患者為實(shí)驗(yàn)組，本院神經(jīng)內(nèi)科收治的20例經(jīng)口服左旋多巴治療原發(fā)性PD患者為對(duì)照組。采用PD統(tǒng)一評(píng)分量表（UPDRS）對(duì)患者治療前及治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行量化評(píng)分。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組20例患者臨床癥狀緩解程度較對(duì)照組明顯，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組治療前UPDRS評(píng)分與治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月的UPDRS評(píng)分的差值分別為［（11.45 ± 2.01）分，（6.25 ± 1.07）分，t = 26.12，P = 0.00］，［（16.1 ± 2.65）分，（7.6 ± 1.47）分，t = 23.19，P = 0.00］，［（20.45 ± 3.28）分，（8.45 ± 1.85）分，t = 20.44，P = 0.00］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 鞘內(nèi)注射UC-MSC治療PD的臨床療效優(yōu)于單純口服左旋多巴片治療PD。

帕金森??； 臍帶； 間質(zhì)干細(xì)胞； 干細(xì)胞移植

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）為常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，主要病理改變?yōu)槟X黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡，導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量顯著減少而致?。?］，臨床表現(xiàn)主要包括靜止性震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)步態(tài)障礙，同時(shí)患者可伴有抑郁、便秘和睡眠障礙等非運(yùn)動(dòng)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生命健康及生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的藥物及手術(shù)治療均無(wú)法逆轉(zhuǎn)神經(jīng)變性，無(wú)法增加多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical cord mesenchymal stem cell， UC-MSC）的多向分化潛能逐漸應(yīng)用于PD的臨床治療中。目前國(guó)內(nèi)有報(bào)道運(yùn)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、UC-MSC經(jīng)頸動(dòng)脈穿刺移植治療PD，但考慮到血腦屏障可能對(duì)治療效果產(chǎn)生影響，我科開(kāi)展采用UC-MSC經(jīng)鞘內(nèi)注射治療20例PD患者的研究，觀察其臨床療效和安全性。

研究分實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組，以治療前以及治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月PD統(tǒng)一評(píng)分量表（unified Parkinson disease rating scale，UPDRS）量化評(píng)分作為主要指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)鞘內(nèi)注射UC-MSC對(duì)PD的臨床療效。

資料與方法

一、病例選擇

實(shí)驗(yàn)組入組標(biāo)準(zhǔn)：本院干細(xì)胞治療科收治的20例原發(fā)性PD患者，采用鞘內(nèi)注射UC-MSC治療PD。對(duì)照組入組標(biāo)準(zhǔn)：本院神經(jīng)內(nèi)科收治的20例原發(fā)性PD患者，采用口服左旋多巴片治療PD。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中患者均為PD Hoehn-Yahr分級(jí)為3-5級(jí)者，并排除合并惡性腫瘤，全身感染、局部嚴(yán)重感染、結(jié)核感染，心、肺、肝、腎等重要臟器的功能障礙者等，對(duì)治療及試驗(yàn)方案知情同意，并且通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方法

1.UC-MSC制備：用于治療PD的UC-MSC均由福建省移植生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行制備。產(chǎn)婦知情同意，通過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，獲取足月妊娠的產(chǎn)婦臍帶。分離UC-MSC：分離并去除臍帶外膜和血管組織，取臍帶基質(zhì)，將其剪碎，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%膠原酶Ⅳ消化過(guò)夜。離心后，取下層沉淀再用0.25%胰蛋白酶37℃消化1 h，過(guò)100目篩網(wǎng)，收集含細(xì)胞的濾液，離心后計(jì)數(shù)，接種于低糖DMEM無(wú)血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。移植前所用臍帶干細(xì)胞均經(jīng)過(guò)檢測(cè)：細(xì)胞呈紡錘狀，病原學(xué)檢查陰性（包括細(xì)菌和真菌等），具有典型的間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型，內(nèi)毒素試驗(yàn)陰性［2］。

2.準(zhǔn)備工作：實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組患者在實(shí)驗(yàn)前一直規(guī)律服用左旋多巴片治療PD 1年以上，病情穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用UC-MSC鞘內(nèi)注射，每周1次，共治療4次；對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)規(guī)律服用左旋多巴片，無(wú)其他特殊治療。實(shí)驗(yàn)后隨訪階段兩組患者均繼續(xù)規(guī)律服用左旋多巴片治療PD。

3.實(shí)驗(yàn)組患者行UC-MSC鞘內(nèi)注射：選擇第3、4腰椎間隙為穿刺點(diǎn)，行常規(guī)消毒鋪巾后，用2%利多卡因行局部麻醉，然后用穿刺針垂直穿刺入蛛網(wǎng)膜下腔，注射器回抽見(jiàn)腦脊液，測(cè)量顱內(nèi)壓，收集5 ml腦脊液行實(shí)驗(yàn)室檢查，再取準(zhǔn)備好的UC-MSC注射液5 ml［干細(xì)胞數(shù)：體重（kg）× 106個(gè)］，于6 ～ 8 min內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，干細(xì)胞鞘內(nèi)注射完畢后，緩慢鞘內(nèi)注射5 mg地塞米松。然后拔出穿刺針，行局部皮膚消毒，無(wú)菌敷料敷蓋創(chuàng)面，平臥觀察10 min，患者無(wú)任何不適后，去枕平臥6 h。在干細(xì)胞移植治療的同時(shí)，給予心電監(jiān)護(hù)、擴(kuò)張血管、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)及對(duì)癥等綜合治療。

三、評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別于治療前和治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月，采用統(tǒng)一PD評(píng)分量表（UPDRS），主要從精神、行為和情緒，日常生活活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)檢查，并發(fā)癥4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

運(yùn)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件，患者年齡、體重、病史以及兩組患者治療前與治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月UPDRS評(píng)分計(jì)量資料以±s表示，并采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異，兩組患者男女比例，伴隨疾病情況計(jì)數(shù)資料用c2檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組患者基本情況

表2　兩組患者治療前后UPDRS總分對(duì)比（分，x

結(jié)　果

一、患者基本情況（表1）

二、療效評(píng)估

實(shí)驗(yàn)組治療前UPDRS評(píng)分為（85.45 ± 4.41）分，治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月UPDRS評(píng)分分別為（74.00 ± 4.32）分、（69.35 ± 3.94）分、（65.00 ± 3.74）分；對(duì)照組治療前UPDRS評(píng)分為（86.80 ± 3.76）分，治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月UPDRS評(píng)分分別為（80.35 ± 3.50）分、（79.00 ± 2.99）分、（78.15 ± 3.91）分，兩組治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月UPDRS評(píng)分均下降，但實(shí)驗(yàn)組下降程度較對(duì)照組明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表2）；對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組治療前與治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月UPDRS評(píng)分差值（d）的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表3）。對(duì)精神、行為和情緒方面進(jìn)行療效評(píng)估，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組經(jīng)治療后UPDRS評(píng)分均下降，治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月，對(duì)照組UPDRS評(píng)分均下降程度大于實(shí)驗(yàn)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05，表4）。對(duì)日常生活活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)檢查2個(gè)方面進(jìn)行療效評(píng)估，經(jīng)治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組UPDRS評(píng)分均下降，實(shí)驗(yàn)組的臨床療效明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表5）。對(duì)并發(fā)癥方面進(jìn)行療效評(píng)估，治療后1個(gè)月、3個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組UPDRS評(píng)分均下降程度大于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05，表6），在治療后6個(gè)月，實(shí)驗(yàn)組UPDRS評(píng)分下降程度大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05，表6）。

表3　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組治療前、后UPDRS評(píng)分差值（d）比較（分，±s）

表3　實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組治療前、后UPDRS評(píng)分差值（d）比較（分，±s）

注：d1：治療前UPDRS評(píng)分與治療后1個(gè)月UPDRS評(píng)分的差值；d2：治療前UPDRS評(píng)分與治療后3個(gè)月UPDRS評(píng)分的差值；d3：治療前UPDRS評(píng)分與治療后6個(gè)月UPDRS評(píng)分的差值

組別例數(shù)d1d2d3實(shí)驗(yàn)組2011.45 ± 2.0116.10 ± 2.65 20.45 ± 3.28對(duì)照組20 6.25 ± 1.07 7.60 ± 1.47　8.45 ± 1.85 t 值26.1223.1920.44 P 值　0.00　0.00　0.00

三、安全性分析

經(jīng)鞘內(nèi)注射UC-MSC后，患者出現(xiàn)乏力癥狀4例、低熱（體溫37.1℃）1例、頭痛1例、腰痛2例，給予對(duì)癥處理后可完全緩解（表7）。

表4　兩組患者治療前后精神、行為和情緒的UPDRS評(píng)分對(duì)比（分，±s）

表4　兩組患者治療前后精神、行為和情緒的UPDRS評(píng)分對(duì)比（分，±s）

組別例數(shù)治療前治療后1個(gè)月治療后3個(gè)月治療后6個(gè)月實(shí)驗(yàn)組207.75 ± 0.976.45 ± 1.005.90 ± 0.794.90 ± 0.64對(duì)照組207.75 ± 0.976.00 ± 0.795.65 ± 0.755.30 ± 0.80 t值01.581.03-1.74 P值10.120.310.09

表5　兩組患者治療前后日常生活活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)檢查的UPDRS評(píng)分對(duì)比（分，±s）

表5　兩組患者治療前后日常生活活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)檢查的UPDRS評(píng)分對(duì)比（分，±s）

日常生活活動(dòng)運(yùn)動(dòng)檢查治療前治療后治療前治療后1個(gè)月3個(gè)月6個(gè)月1個(gè)月3個(gè)月6個(gè)月實(shí)驗(yàn)組2027.65 ± 1.50 23.45 ± 1.96 21.40 ± 1.73 20.25 ± 1.37 36.80 ± 2.42 32.60 ± 2.4430.80 ± 2.44 28.75 ± 2.30對(duì)照組2028.20 ± 2.17 26.30 ± 1.63 25.90 ± 1.52 25.50 ± 1.82 37.65 ± 1.95 35.80 ± 1.7935.25 ± 1.80 35.05 ± 1.96 t值-0.93-5.01-8.75-10.30-1.22-4.73 P值　0.36　0.00　0.00　0.000.230.000.000.00組別例數(shù)

表6　兩組患者治療前后并發(fā)癥的UPDRS評(píng)分對(duì)比（分，±s）

表6　兩組患者治療前后并發(fā)癥的UPDRS評(píng)分對(duì)比（分，±s）

組別例數(shù)治療前治療后1個(gè)月治療后3個(gè)月治療后6個(gè)月實(shí)驗(yàn)組2013.25 ± 2.1511.50 ± 1.7011.25 ± 1.5211.10 ± 1.65對(duì)照組2013.00 ± 1.4912.25 ± 1.3712.20 ± 1.7712.30 ± 1.98 t值0.43-1.53-1.83-2.08 P值0.67　0.13　0.08　0.04

表7　實(shí)驗(yàn)組患者并發(fā)癥發(fā)生情況分析

討　論

UC-MSC是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞，它能分化成許多種組織細(xì)胞，在一定條件下可誘導(dǎo)分化為破骨樣細(xì)胞、心肌樣細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞［3］，并有報(bào)道通過(guò)全反式維甲酸誘導(dǎo)可使臍血多能干細(xì)胞分化成為有功能的多巴胺能神經(jīng)元，這種誘導(dǎo)后產(chǎn)生的臍血多能干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)元表達(dá)酪氨酸羥化酶及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體等多巴胺神經(jīng)元特異性分子標(biāo)志物，為干細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元治療PD提供新的途徑［4］，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。因?yàn)閁C-MSC具備多向分化潛能和自我更新能力，可在一定的條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞，近些年，UC-MSC移植作為治療PD的最前沿方法，其療效備受矚目。

UC-MSC治療的優(yōu)勢(shì)：（1）倫理問(wèn)題不突出，來(lái)源廣泛，易采集，易擴(kuò)增；（2）具有更強(qiáng)的增殖能力，比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞快數(shù)倍；（3）是一種更原始的間充質(zhì)干細(xì)胞群。

經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究觀察，可得出結(jié)果：鞘內(nèi)注射臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療帕金森病的臨床療效優(yōu)于單純口服左旋多巴片治療帕金森病。在精神、行為和情緒方面治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月以及并發(fā)癥發(fā)面治療后1個(gè)月、3個(gè)月，兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因不明，需進(jìn)一步研究其作用機(jī)制；在日常生活活動(dòng)，運(yùn)動(dòng)檢查方面經(jīng)治療后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月以及并發(fā)癥發(fā)面治療6個(gè)月后，實(shí)驗(yàn)組臨床療效明顯優(yōu)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其作用機(jī)制可能為：（1）自我更新和定向分化為多巴胺能神經(jīng)元，UC-MSC移植后能夠定向遷移到病變部位，表達(dá)替代缺損的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，使其發(fā)揮正常的細(xì)胞功能，從而緩解PD的病癥；（2）臍血干細(xì)胞進(jìn)入腦部后，可以誘導(dǎo)分化并且替代受損細(xì)胞恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能和傳導(dǎo)通路，為腦內(nèi)營(yíng)造一個(gè)良好的局部微環(huán)境［5］；（3）分泌多種生物活性因子，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管再生、免疫調(diào)控和抗炎作用等［6］；（4）調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，一項(xiàng)最近的研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可調(diào)控細(xì)胞 ATP、NAD+/NADH比率，降低高濃度谷氨酸對(duì)線粒體膜損傷，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，減少神經(jīng)細(xì)胞變性［7］。

本次研究的不足：（1）樣本量小，為了得到更安全可靠的臨床療效，還應(yīng)進(jìn)行大樣本和長(zhǎng)期的術(shù)后隨訪；（2）未采取盲法，實(shí)驗(yàn)組患者對(duì)鞘內(nèi)注射UC-MSC知情同意，易產(chǎn)生偏移。

與傳統(tǒng)的治療方法相比，UC-MSC治療PD是一種新型且有效的治療方法，具有廣闊的前景，為PD的治療提供了新的希望。

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Efficacy and safety of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on the treatment of Parkinson’s disease

Zhao Tangliang1， Wu Zhengmin2， Wang Ping2， Tan Jianming2.1Department of Urology，F(xiàn)uzhou general hospital of the Second Military Medical University，F(xiàn)u zhou，350025，China；2Department of Stem cell therapy，F(xiàn)uzhou general hospital，F(xiàn)uzhou，350025，China

Tan Jianming， Email：tanjm156@xmu.edu.cn

Objective To evaluate the efficacyand safety of umbilical cord mesenchymal stem cell transplantation on the treatment of Parkinson's disease. Methods Twenty patients with Parkinson's disease were treated with umbilical cord mesenchymal stem cells through the intrathecal injection； 20 cases with Parkinson's disease treated with levodopa served as control. Patients were evaluated by unified Parkinson disease rating scale at baseline， 1 month， 3 months， and 6 months after the treatment. t-test was used to analyze the difference. Results The experimental group had have greater improvement than the control group at 1 month，3 months，6 months， The difference values（d） of the scores before the treatment and 1 month，3 monthes，6 monthes after the treatment of experimental group and control group are respectively（11.45 ± 2.01， 6.25 ± 1.07， t = 26.12， P = 0.00），（16.1 ± 2.65， 7.6 ± 1.47， t = 23.19， P = 0.00）， （20.45 ± 3.28， 8.45 ± 1.85， t = 20.44， P = 0.00），the difference was statistically significant（P ＜ 0.05）.Conclusions Umbilical cord mesenchymal stem cell through the intrathecal injection was more effective than levodopa in treating Parkinson's disease.

Parkinson Disease； umbilical cord； mesenchymal stem cell； stem cell transplantation

2015-09-26）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.007

350025福州，第二軍醫(yī)大學(xué)福州總醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院泌尿外科1；350025福州，南京軍區(qū)福州總醫(yī)院干細(xì)胞治療科2

譚建明，Email：tanjm156@xmu.edu.cn