杜仙娥 付聯(lián)群

（湖北省荊門市第二人民醫(yī)院，湖北 荊門 448000）

速效牙痛寧酊中芫花酯甲的限量測(cè)定

杜仙娥 付聯(lián)群

（湖北省荊門市第二人民醫(yī)院，湖北 荊門 448000）

目的 研究速效牙痛寧酊中芫花酯甲的限量測(cè)定方法。方法 采用Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈：0.01%醋酸溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm，芫花酯甲在7.50～150.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系（r=0.9999），平均加樣回收率為98.9%，RSD為1.09%。結(jié)果 經(jīng)HPLC測(cè)定其芫花酯甲的含量為5.02 μg/mL對(duì)10批制劑進(jìn)行檢測(cè)其含量均＜6.0 μg/mL。 結(jié)論 本方法靈敏度高、準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可用于測(cè)定速效牙痛寧酊中芫花酯甲的限量。

芫花酯甲；速效牙痛寧酊；限量測(cè)定

速效牙痛寧酊為原衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第17冊(cè)（WS3-B-3315-98）收載。本方由芫花根、地骨皮兩味草藥組成。具有活血化瘀，理血止痛。用于風(fēng)蟲牙痛，齲齒性急、慢性牙髓炎，牙本質(zhì)過(guò)敏，楔狀缺損［1］。原標(biāo)準(zhǔn)中只有理化鑒別和檢查項(xiàng)，缺乏對(duì)制劑中藥材的定性定量控制，無(wú)法對(duì)制劑原料藥材進(jìn)行品質(zhì)管控，制劑工藝的科學(xué)性和穩(wěn)定性無(wú)法提供科學(xué)依據(jù)，更是無(wú)法控制成品的內(nèi)在質(zhì)量，臨床用藥療效及安全得不到保障。本制劑在使用過(guò)程中未見(jiàn)不良反應(yīng)。芫花根為瑞香科植物芫花Daphne genkwa Sieb.et Zucc.的干燥根，用于治療水腫等，外用可用于治療風(fēng)火牙痛。但芫花根具有一定毒性，在本制劑中應(yīng)嚴(yán)格控制其毒性成分——芫花酯甲的含量。有報(bào)道在臨床應(yīng)用芫花根的時(shí)候可以去除體積較大的木心，直接應(yīng)用根皮，或用水浸漬后再使用［2］。為了提高本制劑用藥的安全性，有必要對(duì)痕量毒性成分芫花酯甲進(jìn)行限量檢查，本實(shí)驗(yàn)建立了速效牙痛寧酊中芫花酯甲含量的快速測(cè)定方法。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

1　儀器與試藥

Dionex-U3000液相色譜儀（Dionex公司，Dionex Chemeleon色譜工作站）；Mettler Toledo MS104S型電子天平（d=0.01 mg，瑞士Mettler Toledo）公司；芫花酯甲對(duì)照品（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供，紫外、紅外、1H- NMR、13C- NMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC檢測(cè)純度均＞98%，符合含量測(cè)定的要求）；速效牙痛寧酊及缺芫花根的陰性對(duì)照樣品（自制，規(guī)格：50毫升/瓶）乙腈（天津大茂，色譜純）；水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備：取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥器中干燥至恒重的芫花酯甲對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含15.8 μg的溶液，即得。

2.2供試品的制備：精密量取速效牙痛寧酊10 mL搖勻，微孔濾膜濾過(guò)（孔徑0.22 μm），取續(xù)濾液，即得。同法制得不含芫花根的陰性對(duì)照樣品。

2.3系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)與色譜條件：采用以乙腈：0.01%醋酸溶液為流動(dòng)相，采用梯度洗脫［3-5］，色譜柱為：Agilent HC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm，進(jìn)樣量為：10 μL，在此色譜條件下，芫花酯甲色譜峰理論板數(shù)不小于4000，分離度＞1.5。色譜圖見(jiàn)表1和圖1。

2.4線性關(guān)系、檢測(cè)限及定量限考察：精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 mL分別置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，搖勻，得到濃度為0.79、1.58、3.16、7.90、12.64、15.80 μg/mL的芫花酯甲的對(duì)照品溶液。分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以濃度（X）對(duì)峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為：Y=2.1156X+0.5483，r=0.9999；結(jié)果表明芫花酯甲在0.79～15.80 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)信噪比S/N=3確定芫花酯甲檢測(cè)限為0.08 μg/mL，根據(jù)信噪比S/N=10確定芫花酯甲定量限為0.27μg/mL。

2.5精密度試驗(yàn)

表3　樣品測(cè)定結(jié)果（n=4）

表1　梯度洗脫程序

圖1　色譜圖

2.5.1日內(nèi)精密度：分別精密吸取芫花酯甲低、中、高濃度對(duì)照品溶液（0.79、3.16、15.80 μg/mL）10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，RSD分別為1.62%、1.24%、1.58%（n=5），日內(nèi)精密度試驗(yàn)良好。

2.5.2日間精密度：分別精密吸取低、中、高濃度（濃度同日內(nèi)精密度）對(duì)照品溶液各10 μL，每日進(jìn)樣3次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，記錄峰面積，RSD分別為1.89%、2.02%、1.76%（n=5），日間精密度試驗(yàn)結(jié)果符合規(guī)定。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)：取已制備好的速效牙痛寧酊供試品溶液，室溫下分別在0、3、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰面積，計(jì)算其RSD為1.86%，表明處理后的速效牙痛寧酊供試品溶液室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批速效牙痛寧酊樣品（批號(hào)20130708）6份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，結(jié)果芫花酯甲的平均含量為5.02 μg/mL，RSD為1.29%。

2.8加樣回收率試驗(yàn)：稱取重復(fù)性實(shí)驗(yàn)已測(cè)定含量的速效牙痛寧酊樣品（批號(hào)20130708）9份，每份5.0 mL，置10 mL量瓶中，分別加入芫花酯甲對(duì)照品溶液（濃度15.80 μg/mL）1.0、1.5、2.0 mL（3種不同水平，各3份），加甲醇至刻度，搖勻，按上述方法同法制備供試品溶液，進(jìn)樣10μL。按外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算芫花酯甲含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9限量測(cè)定：按上述色譜條件對(duì)5批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3　討 論

芫花始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》具有瀉水逐飲、解毒殺蟲的功效。因毒性較強(qiáng)，古代一直以其炮制品入藥?；瘜W(xué)成分研究表明，芫花根主要含有黃酮、香豆素和萜類化合物?，F(xiàn)代藥理研究表明，芫花根中的二萜原酸酯類化合物——芫花酯甲為其瀉下逐水和不良反應(yīng)的主要組分，該成分具有強(qiáng)烈的刺激性，對(duì)皮膚、黏膜系統(tǒng)有較大的毒害作用［6］。因此通過(guò)對(duì)芫花根及其制劑中芫花酯甲的含量測(cè)定可以有效的控制其質(zhì)量和保證臨床用藥的安全性。芫花及芫花根經(jīng)炮制后芫花酯甲含量下降很多，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，醋煮品中芫花酯甲含量下降為最多，為其降低毒性的最佳炮制方法。

目前，市場(chǎng)上含芫花及芫花根的制劑中均為規(guī)定芫花酯甲的含量限度。給用藥安全留下了很大的隱患，建議國(guó)家藥典委員會(huì)及相關(guān)藥監(jiān)部門制定相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)［7］。本文速效牙痛寧酊中芫花酯甲的檢測(cè)限為5.02 μg/mL，主要用法為外用適量，涂擦患牙處，或用藥棉蘸取藥液1～2滴塞入齲齒窩內(nèi)。避免了內(nèi)服造成的用藥風(fēng)險(xiǎn)。鑒于目前均無(wú)芫花酯甲的含量限度規(guī)定，且本制劑一直沿用至今尚無(wú)不良反應(yīng)報(bào)道，因此本文暫定速效牙痛寧酊中芫花酯甲的檢測(cè)限為6.0 μg/mL。結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)便。

［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì).WS3-B-3315-98中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1998.

［2］應(yīng)百川，王成瑞，周炳南，等.芫花根有效成分的研究［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，1975，35（1）：103-107.

［3］韓偉，章軍，吳立軍，等.芫花根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2009，16（8）：45-46.

［4］黃蘭嵐，李嬈嬈，原思通，等.不同產(chǎn)地芫花藥材中芫花酯甲含量比較［J］.中成藥，2008，30（10）：附10-12.

［5］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：148.

［6］馬天波，劉思貞，徐國(guó)永，等.芫花條化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，1994，25（1）：7.

［7］林武俊，陳小玉，劉可福.跳骨片中馬兜鈴酸的限量測(cè)定［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2014，10（10）；37-38.

282.710.5

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1671-8194（2015）27-0050-03